Verfahren und Einrichtung zur Zellkultivierung sowie Zellkulturträger

专利摘要:
EinVerfahren zur Zellkultivierung umfasst die Schritte: Zubereiteneiner Zellkulturlösung,die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, undAnwenden eines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, um diese durch die Wirkungdes Magnetfeldes zu rühren,wobei die Zellen an den Oberflächender Zellkulturträgerhaften und wachsen. Die Zellkulturträger umfassen jeweils ein magnetischesTeilchen mit einer Deckschicht, die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischenTeilchens bedeckt und auf der die Zellen haften können. DieZellkulturträgerwerden durch Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt,wodurch letztere gerührtwird. Alternativ kann die Zellkulturlösung ferner magnetische Teilchenenthalten, die durch Anwendung des Magnetfeldes bewegt werden, umdie Zellkulturlösungzu rühren.
公开号:DE102004017860A1
申请号:DE102004017860
申请日:2004-04-13
公开日:2004-10-21
发明作者:Kikuka Kishiro；Yae Kurosawa；Ken Sugo；Akira Yamamoto
申请人:Pentax Corp；
IPC主号:C12N5-00

专利说明:
[0001] DieErfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur Zellkultivierungsowie einen Zellkulturträger.
[0002] Inden vergangenen Jahren ist die Technologie der Zellkultivierungauf unterschiedlichen Industrie- und Forschungsgebieten wie derZellgewebsentwicklung, in Sicherheitstests für Arzneimittel, in der Herstellungvon Proteinen zu Behandlungs- oder Diagnosezwecken und dergleichenzur Anwendung gekommen.
[0003] Seitkurzem erfolgt die Zellkultivierung nicht nur mehr an Hand der üblicherweiseeingesetzten Plattenkulturen, sondern auch an Hand von dreidimensionalen,hochdichten Kulturen, auch als Mikroträgerkulturen bezeichnet. Während beieiner Plattenkultur eine Kulturflasche zum Einsatz kommt, werdenbei einer Mikroträgerkultureine Anzahl von perlenartigen Trägernverwendet, die als Gerüstfür dieZellen dienen.
[0004] Beieiner solchen Mikroträgerkulturkommen unterschiedliche Arten von Zellkulturträgern zur Anwendung.
[0005] Beieiner Mikroträgerkulturist es wichtig, die Zellkulturlösungwährenddes Zellkultivierungsprozesses ausreichend lang zu rühren, umdie Trägergleichmäßig in Suspensionzu bringen, so dass die an den Trägern haftenden Zellen in gleicherMenge mit Nahrung versorgt werden.
[0006] Inder Vergangenheit wurde bei einer solchen Mikroträgerkultureine Schleuderflasche verwendet, der einen mit einer Rippe versehenenRührankeraufweist. In einer solchen Schleuderflasche rotiert der Rühranker,wodurch eine Zellkulturlösungumgerührtwird (vergl. Japanische Patentveröffentlichung Hei 06-209761).
[0007] Beieiner Mikroträgerkultur,bei der eine solche Schleuderflasche verwendet wird, besteht jedoch, wenndie Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers zu hoch ist, die Gefahr,dass die Rippe des Rührankers unddie Trägerstark miteinander kollidieren und sich deshalb die Zellen von denTrägernlösen oderbeschädigt werden.Dadurch wird ein ausreichendes Zellwachstum unmöglich. Ist dagegen die Rotationsgeschwindigkeit desRührankerszu gering, so besteht die Gefahr, dass sich die Träger in derRührflaschenach unten absetzen und sie deshalb nicht gleichmäßig genugin der Zellkulturlösungsuspendiert sind. In diesem Fall werden die Zellen nicht in gleicherMenge mit Nahrung versorgt, so dass die gewünschte Wachstumsrate nichterreicht werden kann. Es ist deshalb äußerst wichtig, den Rührankermit einer geeigneten Rotationsgeschwindigkeit zu drehen.
[0008] DenRührankermit einer geeigneten Rotationsgeschwindigkeit zu drehen, ist jedochsehr schwierig und stellt deshalb ein schwerwiegendes Problem beieiner solchen Mikroträgerkulturdar, bei der die oben beschriebene Rührflasche verwendet wird. Außerdem istes erforderlich, die Kultivierungsbedingungen, z.B. die Rotationsgeschwindigkeitdes Rührankers,entsprechend der verwendeten Zellart, der Form der Flasche etc. einzustellen.Auch dies stellt ein Problem dar.
[0009] Aufgabeder Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Einrichtung zur Zellkultivierungsowie einen Zellkulturträgeranzugeben, die es ermöglichen,eine Zellkulturlösunggleichmäßig undsanft umzurühren.
[0010] DieErfindung löstdiese Aufgabe durch die Gegenständeder unabhängigenAnsprüche.Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
[0011] Daserfindungsgemäße Verfahrenumfasst die Schritte: Zubereiten einer Zellkulturlösung, diezumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, aufdenen die Zellen haften und wachsen können, und Anwenden eines Magnetfeldesauf die Zellkulturlösung,um diese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren, wobei die Zellen an denOberflächender Zellkulturträgerhaften und dort wachsen.
[0012] Durchdieses Verfahren kann die Zellkulturlösung gleichmäßig undsanft gerührtwerden, ohne dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern lösen. Diesführt zueinem effizienten Zellwachstum.
[0013] Ineiner Ausführungsformder Erfindung sind die Zellkulturträger jeweils als magnetischesTeilchen mit einer Oberflächeund einer Deckschicht ausgebildet, die zumindest einen Teil derOberflächedes magnetischen Teilchens bedeckt, so dass die Zellen auf der Deckschichthaften können.Die Zellkulturträgerwerden durch Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt,wodurch letztere gerührtwird. Dieses Verfahren ermöglichtes, die lediglich die Zellen und die Zellkulturträger enthaltendeZellkulturlösungzu rühren.
[0014] Indieser Ausführungsformwird vorzugsweise die Intensitätund/oder die räumlicheAnordnung des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldesmit der Zeit geändert.Dadurch kann die Zellkulturlösungnoch gleichmäßiger undsanfter gerührtwerden.
[0015] DieDichte jedes Zellkulturträgersliegt vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 2,5 g/cm³.Dies ermöglicht es,die Zellkulturlösungin ausreichendem Maßezu rühren.
[0016] Istdie mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger alsA μm unddie maximale Längeder an dem jeweiligen Zellkulturträger anzuhaltenden Zelle alsB μm definiert,so liegt das VerhältnisA/B vorzugsweise bei 2 bis 100. Dadurch kann die Oberfläche desZellkulturträgersim Verhältniszur Größe der Zelleausreichend groß ausgebildetwerden, was die Zellanhaftung und das Zellwachstum an der Oberflächen desZellkulturträgerserleichtert.
[0017] Vorzugsweiseliegt der mittlere Teilchendurchmesser der Zellkulturträger im Bereichvon 50 bis 500 μm.
[0018] DieDeckschicht besteht vorzugsweise hauptsächlich aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung.Da eine solche Calciumphosphat-basierte Verbindung biologisch inertist, ist die Gefahr einer Zellschädigung gering.
[0019] Vorzugsweiseist die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindunggebildet, wobei diese Teilchen zum Teil in einem Oberflächenbereicheingebettet werden, der die Oberfläche des magnetischen Teilchensumfasst und an diese angrenzt. Dadurch wird eine ausgezeichneteHaftung zwischen der Deckschicht und dem magnetischen Teilchen erreicht.
[0020] DieDeckschicht kann hergestellt werden, indem die porösen Teilchender Calciumphosphat-basierten Verbindung mit der Oberfläche desmagnetischen Teilchens in Kollision gebracht werden. Dadurch wirddie Herstellung der Deckschicht besonders einfach und zuverlässig.
[0021] Vorzugsweisewerden die magnetischen Teilchen jeweils durch Mischen eines Harzmaterialsund eines magnetischen Materials gebildet. Durch dieses Verfahrenist es möglich,die Dichte (spezifisches Gewicht) des magnetischen Teilchens unddamit auch des Zellkulturträgersinsgesamt einzustellen, indem das Mischverhältnis zwischen dem Harzmaterialund dem magnetischen Material geeignet festge legt wird. So können auchForm und Größe des jeweiligenZellkulturträgerseinfach eingestellt werden.
[0022] Ineiner anderen Ausführungsformder Erfindung enthältdie Zellkulturlösungferner magnetische Teilchen, die durch Anwendung des Magnetfeldesin der Zellkulturlösungbewegt werden. Dadurch wird die Zellkulturlösung gerührt. Bei diesem Verfahren istes also möglich,einfach durch Zugabe der magnetischen Teilchen in die Zellkulturlösung zusätzlich zuden dort vorhandenen Zellen und Zellkulturträgern die Zellkulturlösung gleichmäßig undsanft zu rühren.
[0023] Gemäß einemweiteren Aspekt der Erfindung ist eine Einrichtung zur Zellkultivierungvorgesehen. Diese Einrichtung umfasst ein Kultivierungsgefäß zur Aufnahmeeiner Zellkulturlösung,die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, aufdenen die Zellen haften und wachsen können, sowie mindestens einenMagnetfeldgenerator zum Anwenden eines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, umdiese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren. Mit dieser Einrichtungist es möglich,die Zellkulturlösung gleichmäßig undsanft zu rühren,ohne dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern lösen. Dies ermöglicht eineffizientes Zellwachstum. In einer vorteilhaften Weiterbildung dieserEinrichtung ist der Magnetfeldgenerator so ausgebildet, dass dieIntensitätund/oder die Anordnung des erzeugten Magnetfeldes mit der Zeit veränderbarist. Dadurch ist es möglich,die Zellkulturlösungnoch gleichmäßiger undsanfter zu rühren.
[0024] Vorzugsweiseist der Magnetfeldgenerator um die Außenfläche des Kultivierungsgefäßes herumangeordnet. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist derMagnetfeldgenerator so angeordnet, dass er in Kontakt mit der Zellkulturlösung kommt.Außerdemkann der Magnetfeldgenerator in einer vorzugsweisen Weiterbildungin der Nähedes flüssigenOberflächeder in dem Kultivierungsgefäß enthaltenenZellkulturlösung angeordnetsein. Alle diese Ausgestaltungen ermöglichen es, die Zellkulturträger oderdie magnetischen Teilchen in der Zellkulturlösung weitläufig nach oben und nach untenzu bewegen, um die Zellkulturlösungnoch gleichmäßiger zurühren.
[0025] Vorzugsweiseumfasst der mindestens eine Magnetfeldgenerator zwei oder mehr Magnetfeldgeneratoren.Dadurch könnendie Zellkulturträgeroder die magnetischen Teilchen in der Zellkulturlösung gemäß einemerwünschten,komplizierten Muster bewegt werden.
[0026] DieErfindung wird im Folgenden an Hand der Figuren näher erläutert. Darinzeigen:
[0027] 1 einen Querschnitt einesZellkulturträgers,der in einem Zellkultivierungsverfahren nach einem ersten Ausführungsbeispielverwendet wird,
[0028] 2 einen Querschnitt einesZellkulturträgers,der in einem Zellkultivierungsverfahren nach einem zweiten Ausführungsbeispielverwendet wird,
[0029] 3 einen Querschnitt einesmagnetischen Teilchens, das in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitemAusführungsbeispielverwendet wird,
[0030] 4 einen Querschnitt einesmodifizierten magnetischen Teilchens, das in dem Zellkultivierungsverfahrennach zweitem Ausführungsbeispielverwendet wird,
[0031] 5 eine schematische, perspektivischeDarstellung einer Zellkultivierungseinrichtung nach einem erstenAusführungsbeispiel,
[0032] 6 ein Zeitdiagramm, welchesdas Muster eines magnetischen Feldes zeigt, das von einem Magnetfeldgeneratorder Zellkultivierungseinrichtung nach erstem Ausführungsbeispielerzeugt wird,
[0033] 7 eine schematische, perspektivischeDarstellung einer Zellkultivierungseinrichtung nach einem zweitenAusführungsbeispiel,
[0034] 8 eine schematische, perspektivischeDarstellung einer Zellkultivierungseinrichtung nach einem drittenAusführungsbeispiel,
[0035] 9 ein Zeitdiagramm, welchesdas Muster eines Magnetfeldes zeigt, das von einem Magnetfeldgeneratorder Zellkultivierungseinrichtung nach drittem Ausführungsbeispielerzeugt wird.
[0036] DieErfindung wird auf eine Schleuderkultur angewandt, in der es Zellenermöglichtwird, in einem Suspensionszustand in einer Zellkulturlösung (flüssiges Medium)zu wachsen, währenddie Zellkulturlösunggerührtwird.
[0037] Ineiner solchen Schleuderkultur werden, insbesondere wenn verankerungsabhängige Zellenkultiviert werden, die Zellen und Zellkulturträger in einer Zellkulturlösung inSuspension gebracht, und es wird den Zellen ermöglicht, in einem Zustand, indem sie an den Oberflächender Trägerhaften, zu wachsen.
[0038] EinZellkultivierungsverfahren, das mit solchen Zellkulturträgern arbeitet,wird als Mikroträgerkultivierungbezeichnet. Die Erfindung ist vorteilhaft auf diese Mikroträgerkultivierunganwendbar.
[0039] ImFolgenden werden ein Zellkultivierungsverfahren, Zellkulturträger sowieeine Zellkultivierungseinrichtung nach der Erfindung an Hand vonbevorzugten Ausführungsbeispielenbeschrieben, in denen die Erfindung auf die oben beschriebene Mikroträgerkultivierungangewandt wird.
[0040] Zunächst wirdein Zellkultivierungsverfahren nach einem ersten Ausführungsbeispielbeschrieben. Das erste Ausführungsbeispielder Erfindung ist auf ein Zellkultivierungsverfahren gerichtet,das Verfahrensschritte umfasst, in denen eine Zellkulturlösung zubereitetwird, die zu kultivierende Zellen und granulöse oder körnige Zellkulturträger mitmagnetischen Teilchen enthält,und die Zellkulturlösungmit einem Magnetfeld beaufschlagt wird, so dass die Zellkulturträger in derZellkulturlösungdurch die Wirkung des angelegten Magnetfeldes bewegt werden undso die Zellkulturlösungumrühren,währenddie Zellen an den Oberflächender Zellkulturträgerhaften und darauf wachsen.
[0041] Wieoben beschrieben, werden in diesem Verfahren Zellkulturträger verwendet,die auf das Magnetfeld reagieren. 1 zeigteinen Querschnitt eines solchen Zellkulturträgers.
[0042] Nach 1 besteht ein Zellkulturträger 1 auseinem magnetischen Teilchen 2 und einer Deckschicht 3,welche die Oberflächedes magnetischen Teilchens 2 so bedeckt, dass Zellen aufihr wachsen können.Wird der Zellkulturträgermit einem Magnetfeld beaufschlagt, so wird er in einer Zellkulturlösung bewegt,wodurch die Zellkulturlösunggleichmäßig undsanft gerührtwird. Es ist deshalb fürdie Zellen leicht, an der Oberfläche desZellkulturträgers 1 zuhaften. Außerdemwird jede Zelle in gleicher Menge mit Nahrung versorgt. Der Zellkulturträger 1 bildetdemnach ein gutes Gerüstfür dasZellwachstum.
[0043] Beidem erfindungsgemäßen Verfahrenkönnenmechanische Stöße auf dieZellkulturträger 1 vermiedenwerden, die bei dem herkömmlichen,mit einer Rührflaschearbeitenden Verfahren durch die Kollision einer Rührrippemit den Zellkulturträgernauftreten. Dadurch kann verhindert werden, dass die an den Zellkulturträgern 1 haftendenZellen von deren Oberflächenabfallen oder beschädigtwerden.
[0044] Dasmagnetische Teilchen 2 bildet die Basis des jeweiligenZellkulturteilchens 1. Das magnetische Teilchen 2 kannaus einem magnetischen Material bestehen. Vorzugsweise ist jedochdas magnetische Teilchen 2 aus einem Komposit- oder Verbundmaterialgebildet, das man durch Mischen eines Harzmaterials mit einem magnetischenMaterial erhält.Die Dichte (spezifisches Gewicht) des magnetischen Materials (d.h.des Zellkulturträgers 1)kann dabei in einfacher Weise eingestellt werden, indem das Mischverhältnis vonHarzmaterial und magnetischem Material geeignet eingestellt wird.Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass Form und Größe (z.B.mittlere Teilchengröße) desZellkulturträgers 1 ineinfacher Weise eingestellt werden können.
[0045] Dasmagnetische Teilchen 2 ist nach 1 vorzugsweise so aufgebaut, dass einmagnetisches Material (magnetisches Pulver) 22 in einemBasismaterial 21 dispergiert, d.h. verteilt ist, das hauptsächlich aus demHarzmaterial besteht. Das magnetische Teilchen 2 kann vergleichsweiseeinfach hergestellt werden, indem ein Harzmaterial, dem das magnetischeMaterial zugemischt worden ist, im geschmolzenen Zustand geformtoder granuliert wird. Es ist darauf hinzuweisen, dass bei dem inForm eines Verbundteilchens vorliegenden magnetischen Teilchen dasmagnetische Material nur in einem Teil des Basismaterials 21,der sich in der Nähevon dessen Oberflächebefindet, dispergiert sein kann.
[0046] Beispielefür dasmagnetische Material 22 sind eine ferromagnetische Legierung,die Eisenoxid, Fe, Ni, Co oder dergleichen als Hauptbestandteilenthält,Ferrit, Bariumferrit, Strontiumferrit und dergleichen. Diese magnetischenMaterialien könnenallein oder in Kombination von zwei oder mehr Materialien eingesetzt werden.
[0047] AlsHarzmaterial könnenverschiedene wärmehärtbare Harzeund verschiedene thermoplastische Harze verwendet werden. Beispielefür thermoplastischeHarze sind Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyimid,ein Acrylharz und ein thermoplastisches Polyurethan. Beispiele für wärmehärtbare Harze sindein Epoxyharz, ein Phenolharz, ein Melaminharz, ein Harnstoffharz,ein ungesättigtesPolyester, ein Alkydharz, ein wärmehärtendesPolyurethan und Ebonit. Diese Harzmaterialien können allein oder in Kombinationvon zwei oder mehr Materialien verwendet werden.
[0048] DasHarzmaterial kann mit organischen Pigmenten, anorganischen Pigmenten,sauren Farbstoffen, basischen Farbstoffen oder dergleichen gefärbt sein.
[0049] DieDeckschicht 3 besteht aus einem Material, an dem Zellenhaften. Ein solches Material ist beispielsweise Polystyrol, Polyacrylamid,Cellulose, Dextran und dergleichen. Besonders bevorzugt ist jedochein Material, das eine Calciumphosphat-basierte Verbindung als Hauptbestandteilenthält.So ist eine Calciumphosphat-basierte Verbindung biologisch inertund damit hinsichtlich einer Zellschädigung vergleichsweise ungefährlich.
[0050] Enthält die Deckschicht 3 dieCalciumphosphat-basierte Verbindung als Hauptbestandteil, so fängt sie vondem magnetischen Material 22 erzeugte Metallionen ein undverhindert so, dass die Metallionen in die Zellkulturlösung eluieren.Dadurch kann ein nachteiliger Einfluss auf die Zellen vermiedenwerden. Die Deckschicht 3 bildet also in diesem Fall eineIonenschutzschicht.
[0051] DieCalciumphosphat-basierte Verbindung unterliegt keinen besonderenBeschränkungen.So können verschiedenartigeVerbindungen mit einem Ca/P-Verhältnis von1,0 bis 2,0 verwendet werden. Beispiele für eine solche Verbindung sind (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), Ca₁₀(PO₄)₆F₂,Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂, Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂ und CaHPO₄. Diese Verbindungen können allein oder in Kombinationvon zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden.
[0052] Unterden genannten Calciumphosphat-basierten Verbindungen ist eine Verbindung,die Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) als Hauptbestandteilenthält,am besten geeignet. Hydroxylapatit wird als Biomaterial eingesetzt,da Zellen mit hoher Effizienz an ihm haften und es nur eine sehrgeringe Wahrscheinlichkeit aufweist, zellschädigend zu wirken.
[0053] WirdFluorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆F₂) verwendet, sobeträgtder Fluorgehalt in der gesamten Calciumphosphat-basierten Verbindungvorzugsweise 5 Gew.-% oder weniger. Indem der Fluorgehalt in dergesamten Calciumphosphat-basierten Verbindung auf 5 Gew.-% oderweniger eingestellt wird, kann die Eluierung von Fluor aus der Deckschicht(d.h. aus dem Zellkulturträger)vermieden oder wenigstens minimiert werden. Deshalb kann auch eineZellschädigungvermieden oder minimiert werden, so dass eine Herabsetzung der Effizienz desZellwachstums verhindert werden kann.
[0054] DieseCalciumphosphat-basierten Verbindungen können nach bekannten Verfahrenwie der Nass-Synthese, der Trocken-Synthese oder dergleichen synthetisiertwerden. In diesem Fall enthältdie resultierende Calciumphosphat-basierte Verbindung möglicherweiseeine Substanz, die als Ergebnis der Synthese (z.B. als Rohmaterialoder dergleichen) zurückbleibt,und/oder ein sekundäresReaktionsprodukt, das im Laufe der Synthese erzeugt worden ist.
[0055] Bestehtdie Deckschicht 3 hauptsächlich aus der Calciumphosphat-basiertenVerbindung, so kann sie in der Weise ausgebildet werden, dass dieCalciumphosphat-basierte Verbindung auf der Oberfläche desmagnetischen Teilchens 2 adsorbiert wird. Vorzugsweiseist jedoch, wie in 1 gezeigt,die Deckschicht 3 aus feinen, aus der Calciumphosphat-basiertenVerbindung bestehenden Teilchen 31 gebildet, die teilweisein einem Oberflächenbereicheingebettet sind, der die Oberflächedes magnetischen Teilchens 2 umfasst und an diese grenzt.Dieses sorgt füreine ausgezeichnete Haftung zwischen der Deckschicht 3 unddem magnetischen Teilchen 2, so dass eine Ablösung derDeckschicht 3 von der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 sichervermieden wird. Der Zellkulturträger 1 hatdeshalb eine ausreichende Festigkeit.
[0056] DieDeckschicht 3 kann gebildet werden, indem poröse Teilchen,die aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen, in Kollisionmit der Oberflächedes magnetischen Teilchens 2 gebracht werden. Auf dieseWeise kann die Deckschicht 3 einfach und zuverlässig hergestelltwerden.
[0057] Wenndie porösenTeilchen mit der Oberflächedes magnetischen Teilchens 2 kollidieren, brechen sie indie feinen Teilchen 31 auf, deren Teilchengröße durch dieKollision mit dem magnetischen Teilchen 2 deutlich verringertist. Einige der Teilchen 31 werden teilweise in das magnetischeTeilchen 2 eingebettet. Das magnetische Teilchen 2 fängt dabeidie Teilchen 31 infolge seiner elastischen Wirkung ein,wodurch die Teilchen 31 auf der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 festgehaltenwerden.
[0058] DieporösenTeilchen werden vorzugsweise durch Agglomeration von aus der Calciumphosphat-basiertenVerbindung bestehenden Primärteilchenhergestellt. Durch die Verwendung solcher poröser Teilchen kann die Oberfläche desmagnetischen Teilchens 2 noch zuverlässiger beschichtet werden,da die porösen Teilchenbei ihrer Kollision mit den magnetischen Teilchen 2 besonderswirksam fragmentiert werden.
[0059] Diemittlere Teilchengröße der porösen Teilchenist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch vorzugsweisebei 100 μmoder weniger. Übersteigtder mittlere Teilchendurchmesser der porösen Teilchen 100 μm, so istdie Geschwindigkeit der porösenTeilchen bei ihrer Kollision mit den magnetischen Teilchen 2 möglicherweiseso gering, dass sie nicht effizient fragmentiert werden.
[0060] DieKollision zwischen den magnetischen Teilchen 2 und denporösenTeilchen kann beispielsweise unter Verwendung eines handelsüblichenHybridisierungsgerätesim trockenen Zustand erfolgen. Dabei erfolgt die Kollision z.B.bei einem Mischverhältniszwischen den magnetischen Teilchen 2 und den porösen Teilchen vonetwa 400:1 bis 50:1 (gewichtsbezogen) und einer Temperatur in demGerät,die gleich oder kleiner als die Erweichungstemperatur des Kunstharzmaterialsist, das als Hauptmaterial fürdie magnetischen Teilchen 2 verwendet wird (üblicherweise80°C oderweniger).
[0061] SolcheporösenTeilchen könnenbeispielsweise auch in bekannter Weise wie folgt hergestellt werden.
[0062] DieporösenTeilchen könnendurch direktes Sprühtrockneneines Breis hergestellt werden, der kristalline Teilchen (Primärteilchen)einer nach einem bekannten Nassverfahren synthetisierten Calciumphosphat-basiertenVerbindung enthält,um körnigeSekundärteilchenzu erzeugen. Alternativ könnensolche Sekundärteilchenerzeugt werden, indem dem Brei ein Additiv zugegeben wird, z.B.in Form von die Viskosität einstellendenTeilchen aus einer organischen Verbindung, in Form von Fasern, diedurch Erhitzen verdampft werden können, oder dergleichen, unddann der Brei sprühgetrocknetwird. Die so erhaltenen Sekundärteilchenkönnennach Bedarf auch noch gesintert werden.
[0063] Dadie so erhaltenen Sekundärteilchenporös sind,könnensie direkt zur Herstellung der Deckschicht 3 verwendetwerden.
[0064] SollenporöseTeilchen mit einer höherenPorositätverwendet werden, so könnendiese beispielsweise wie folgt hergestellt werden.
[0065] Zunächst wirdein Brei zubereitet, in dem die oben beschriebenen Sekundärteilchensuspendiert sind, und der Brei durch Nassformen, Trockenpressenoder dergleichen in eine Blockform gebracht. Dabei kann dem Breieine organische Verbindung zugegeben werden, die in dem folgendenSinterprozess verdampft wird, um Poren zu erzeugen. Der Porendurchmesserkann auch an Stelle der Zugabe einer solchen organischen Verbindungdurch Einstellen der Prozessbedingungen, z.B. der Sintertemperaturoder dergleichen, kontrolliert werden. Der so erhaltene Block wirddann bei einer Temperatur im Bereich von etwa 400 bis 1300°C gesintert. Liegtdie Sintertemperatur unter 400°C,so ist zu befürchten,dass die organische Verbindung nicht vollständig verdampft oder der Blocknicht ausreichend gesintert wird. Erfolgt dagegen das Sintern beieiner 1300°C übersteigendenTemperatur, so ist zu befürchten,dass der resultierende Sinterkörper übermäßig dichtwird oder sich die Calciumphosphat-basierte Verbindung zersetzt.
[0066] Anschließend wirdder gesinterte Block zermahlen und klassifiziert, um Teilchen mitder gewünschten Teilchengröße zu erhalten.
[0067] DerPorendurchmesser der porösenTeilchen kann eingestellt werden, indem beispielsweise die Größe der Primärteilchen,die Viskositätdes Breis, die Art des Additivs oder dergleichen geeignet eingestelltwerden.
[0068] Dasso erhaltene poröseTeilchen hat vorzugsweise eine spezifische Oberfläche von10 m²/g oder mehr und einen Porendurchmesservon etwa 500 bis 1000 Å.Der Zellkulturträger 1,der unter Verwendung der den oben beschriebenen Anforderungen genügenden porösen Teilchenhergestellt wird, ermöglichtes den Zellen, noch effizienter an seiner Oberfläche zu haften und zu wachsen.
[0069] DasVerfahren zum Herstellen der Deckschicht 3 und damit zumHerstellen des Zellkulturträgers 1 ist nichtauf das oben beschriebene Verfahren beschränkt.
[0070] DieDeckschicht 3 kann dicht oder porös sein.
[0071] Diemittlere Dicke der Deckschicht 3 ist nicht auf einen bestimmtenWert beschränkt,liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 5 μm, noch besserim Bereich von etwa 0,5 bis 2 μm.Ist die mittlere Dicke der Deckschicht 3 kleiner als dervorstehend genannte untere Grenzwert, so ist zu befürchten,dass ein Teil der Oberflächedes magnetischen Teilchens 2 in dem Zellkulturträger 3 freiliegt. Übersteigtdagegen die mittlere Dicke der Deckschicht 3 den vorstehendgenannten oberen Grenzwert, so wird es schwierig, die Dichte desZellkulturträgers 1 einzustellen.
[0072] Esist von Vorteil, dass der Zellkulturträger 1 bei Anlegeneines Magnetfeldes leicht in einer Zellkulturlösung bewegt werden kann undsich bei Abschalten des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung nachunten absetzt oder abscheidet. Durch Verwendung der Zellkulturträger 1 kanndie Zellkulturlösungeinfach und zuverlässiggerührtwerden.
[0073] Unterdiesem Gesichtspunkt liegt die Dichte (spezifisches Gewicht) jedesZellkulturträgers 1 vorzugsweiseim Bereich von etwa 0,8 bis 2,5 g/cm³, nochbesser im Bereich von etwa 1,0 bis 1,2 g/cm³.Ist die Dichte der Zellkulturträger 1 zuklein, so wird es fürdie Zellkulturträger 1 schwierig,sich bei Beseitigung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung nachunten abzusetzen. Ist dagegen die Dichte der Zellkulturträger 1 zugroß,so muss ein übermäßig großes Magnetfeldangelegt werden, um die Zellkulturträger 1 in der Zellkulturlösung zu bewegen.In beiden Fällenbesteht die Gefahr, dass die Zellkulturlösung nicht ausreichend gerührt wird.
[0074] DieAbmessung des Zellkulturträgers 1 istnicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorteilhaft ist sie jedochbeispielsweise wie folgt gewählt.
[0075] Istdie mittlere Teilchengröße des Zellkulturträgers 1 alsA (μm) unddie maximale Längeeiner Zelle, die an dem Zellkulturträger 1 haften darf,als B (μm)definiert, so liegt das VerhältnisA/B vorzugsweise bei etwa 2 bis 100, noch besser bei etwa 5 bis50. Wird das VerhältnisA/B auf einen Wert eingestellt, der in dem vorstehend genanntenBereich liegt, so kann die Oberfläche jedes Zellkulturträgers 1 bezogenauf die Größe der Zelleausreichend vergrößert werden,wodurch es den Zellen möglichwird, noch einfacher an der Oberfläche des jeweiligen Zellkulturträgers 1 zuhaften und dort zu wachsen.
[0076] Auspraktischen Erwägungenliegt der mittlere Teilchendurchmesser der Zellkulturteilchen 1 vorzugsweiseim Bereich von etwa 50 bis 500 μm,noch besser im Bereich von etwa 100 bis 300 μm. Indem der mittlere Teilchendurchmesserder Zellkulturteilchen 1 auf einen innerhalb des oben angegebenenBereichs liegenden Wert eingestellt wird, können die oben beschriebenenWirkungen noch weiter verbessert werden.
[0077] Umes einer noch größeren Zahlan Zellen zu ermöglichen,an den Oberflächender Zellkulturträger 1 zuhaften und zu wachsen, ist vorzugsweise weitgehend die gesamte Oberfläche jedesmagnetischen Teilchens 2 mit der Deckschicht 3 bedeckt,wie dies in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel der Fall ist.Jedoch kann der jeweilige Zellkulturträger 1 auch so aufgebautsein, dass nur ein Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 inAbhängigkeitder mit dem Zellkulturträger 1 zukultivierenden Zellart, der Art des das magnetische Teilchen 2 bildendenMaterials oder dergleichen mit der Deckschicht 3 bedecktist. Bei diesem Aufbau liegt also ein Teil der Oberfläche desmagnetischen Teilchens 2 durch die in der Deckschicht 3 vorhandenenLückenfrei.
[0078] ImFolgenden werden ein Zellkultivierungsverfahren nach einem zweitenAusführungsbeispielsowie in diesem Verfahren verwendete Zellkulturträger undmagnetische Teilchen beschrieben.
[0079] Daszweite Ausführungsbeispielist auf ein Zellkultivierungsverfahren gerichtet, das Verfahrensschritte enthält, in deneneine Zellkulturlösung,die zu kultivierende Zellen, körnigeZellkulturteilchen und magnetische Teilchen enthält, zubereitet und die Zellkulturlösung miteinem Magnetfeld beaufschlagt wird, um die magnetischen Teilchenin der Zellkulturlösungzu bewegen und so die Zellkulturlösung zu rühren, wodurch es den Zellenermöglichtwird, an den Oberflächender Zellkulturträgerzu haften und zu wachsen.
[0080] Beidem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel werden zunächst diemagnetischen Teilchen sowie die Zellen und die Zellkulturträger derZellkulturlösungzugegeben. Dann werden durch Beaufschlagung der Zellkulturlösung miteinem Magnetfeld die magnetischen Teilchen in der Zellkulturlösung bewegt,so dass letztere gerührtwird. In diesem Zustand haften und wachsen die Zellen an den Oberflächen derZellkulturträger.
[0081] Indiesem Ausführungsbeispielist es möglich,eine Zellkulturlösunggleichmäßig undsanft zu rühren, waszu einem effizienten Zellwachstum führt.
[0082] Wiespäternoch genauer beschrieben wird, ermöglicht es dieses Zellkulturverfahrendurch zeitliche Änderungder Intensitätoder der räumlichenAnordnung eines auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldesdie Zellkulturlösunggleichmäßig zu rühren.
[0083] ImFolgenden werden die Komponenten des Zellkulturverfahrens nach zweitemAusführungsbeispiel nacheinanderbeschrieben.
[0084] 2 ist ein Querschnitt, derden Aufbau des in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispielverwendeten Zellkulturträgerszeigt. 3 ist ein Querschnitt,der den Aufbau des in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitemAusführungsbeispielverwendeten magnetischen Teilchens zeigt. 4 ist ein Querschnitt, der eine Modifizierungdes in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispielverwendeten magnetischen Teilchens zeigt.
[0085] Wiein dem ersten Ausführungsbeispieldient ein Zellkulturträger 1A alsGerüstfür dasZellwachstum und ist körnigoder partikelförmig(vorzugsweise weitgehend sphärisch)ausgebildet.
[0086] AlsZellkulturträgerkann ein (üblicherweisein einer Mikroträgerkultureingesetzter) Trägerverwendet werden, der aus einem Material besteht, das als HauptbestandteilPolystyrol, Polyacrylamid, Cellulose, Dextran oder dergleichen enthält. In demzweiten Ausführungsbeispielwerden jedoch die Zellkulturträger 1A verwendet,die jeweils den in 2 gezeigtenAufbau haben. Jeder dieser Zellkulturträger 1A besteht auseinem Basiskörper 11 undeiner Deckschicht 12, welche die Oberfläche des Basiskörpers 11 bedeckt,so dass es Zellen ermöglichtwird, an der Deckschicht 12 zu haften.
[0087] Derin 2 gezeigte Aufbaudes Zellkulturträgers 1A erlaubtes, dass die Zellen in geeigneter Weise an dem Zellkulturträger 1A haftenund wachsen. Außerdemerleichtert es dieser Aufbau, Form, Größe (z.B. mittlere Teilchengröße) undphysikalische Eigenschaften (z.B. Dichte) des Zellkulturträgers 1A einzustellen.Im Folgenden wird der Zellkulturträger 1A genauer beschrieben.
[0088] DerBasiskörper 11 bestehtvorzugsweise aus einem Harzmaterial. Die Verwendung dieses Basiskörpers 11 führt zu einerweiteren Verbesserung der oben beschriebenen technischen Wirkung.
[0089] AlsHarzmaterial könnenverschiedenartige wärmehärtbare Harzeund verschiedenartige thermoplastische Harze verwendet werden. Beispielefür einthermoplastisches Harz sind Polyamid, Polyethylen, Polypropylen,Polystyrol, Polyamid, ein Acrylharz und ein thermoplastisches Polyurethan.Beispiele fürein wärmehärtbaresHarz sind ein Epoxyharz, ein Phenolharz, ein Melaminharz, ein Harnstoffharz,ein ungesättigtesPolyester, ein Alkydharz, ein wärmehärtbaresPolyurethan und Ebonit. Diese Harze können allein oder in Kombination vonzwei oder mehr Materialien verwendet werden.
[0090] Außerdem kanndas Harz Material mit organischen Pigmenten, anorganischen Pigmenten,sauren Farbstoffen, basischen Farbstoffen oder dergleichen gefärbt sein.
[0091] Alsdie Deckschicht 12 bildendes Material kann ein beliebigesMaterial verwendet werden, sofern Zellen an ihm haften können. Insbesondereist ein Material geeignet, das eine Calciumphosphat-basierte Verbindungals Hauptmaterial enthält.Die Calciumphosphat-basierte Verbindung ist deshalb von Vorteil,da sie biologisch inert ist und nur eine geringe Wahrscheinlichkeitdafür besteht,dass sie Zellen schädigt.
[0092] DieCalciumphosphat-basierte Verbindung unterliegt keinen besonderenBeschränkungen.Es sind verschiedenartige Verbindungen mit einem Ca/P-Verhältnis von1,0 bis 2,0 verwendbar. Beispiele für eine solche Verbindung sind(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂,Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂ und CaHPO₄. DieseVerbindungen könnenallein oder in Kombination von zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden.
[0093] Unterden genannten Calciumphosphat-basierten Verbindungen ist eine Verbindung,die Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) als Hauptbestandteilenthält,am besten geeignet. Hydroxylapatit wird als Biomaterial verwendet,da Zellen mit hoher Effizienz an ihm haften und nur eine geringeWahrscheinlichkeit besteht, dass es die Zellen schädigt.
[0094] WirdFluorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆F₂) verwendet, sobeträgtder Fluorgehalt in der gesamten Calciumphosphat-basierten Verbindung5 Gew.-% oder weniger. Indem der Fluorgehalt in der gesamten Calciumphosphat-basiertenVerbindung auf 5 Gew.-% oder weniger eingestellt wird, kann dieEluierung von Fluor aus der Deckschicht 12 und damit ausdem Zellkulturträger 1A verhindertoder zumindest minimiert werden. Dementsprechend kann eine Zellschädigung vermiedenoder zumindest minimiert werden, so dass eine Reduzierung der Effizienzdes Zellwachstums verhindert wird.
[0095] DieseCalciumphosphat-basierten Verbindungen können nach bekannten Verfahrenwie der Nass-Synthese, der Trocken-Synthese oder dergleichen synthetisiertwerden. In diesem Fall enthältdie resultierende Calciumphosphat-basierte Verbindung möglicherweiseeine Substanz, die als Ergebnis der Synthese (z.B. ein Rohmaterial)zurückbleibt,und/oder ein sekundäresReaktionsprodukt, das im Laufe der Synthese gebildet wird.
[0096] Wirddie Deckschicht 12 aus der Calciumphosphat-basierten Verbindunggebildet, so kann sie in der Weise hergestellt werden, dass mandie Calciumphosphat-basierteVerbindung auf der Oberflächedes Basiskörpers 11 adsorbierenlässt.Wie in 2 gezeigt, istdie Deckschicht 12 vorzugsweise aus Teilchen 12 der Calciumphosphat-basiertenVerbindung gebildet, die teilweise in einen Oberflächenbereicheingebettet sind, der die Oberflächedes Basiskörpers 11 umfasstund an diese angrenzt. Dadurch wird für eine ausgezeichnete Haftungzwischen der Deckschicht 12 und dem Basiskörper 11 gesorgt.Diese Haftung verhindert, dass sich die Deckschicht 12 vonder Oberflächedes Basiskörpers 11 löst. DerZellkulturträger 1A hatdeshalb eine ausreichende Festigkeit.
[0097] Indiesem Fall kann die Deckschicht 12 beispielsweise gebildetwerden, indem poröseTeilchen, die hauptsächlichaus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen, in Kollisionmit der Oberflächedes Basiskörpers 11 gebrachtwerden. In einem solchen Verfahren kann die Deckschicht 12 einfachund zuverlässiggebildet werden. Durch die Kollision der porösen Teilchen mit der Oberfläche desBasiskörpers 11 brechen dieporösenTeilchen in feine Teilchen 13 auf, die beträchtlichkleiner sind als die mit dem Basiskörper 11 kollidierendenTeilchen. Die Teilchen 13 werden so teilweise in den Basiskörper 11 eingebettet.Bei dieser Einbettung fängtder Basiskörper 11 dieTeilchen 13 infolge seiner elasti schen Wirkung ein, wodurchdie Teilchen 13 an dem Basiskörper 11 festgehaltenwerden.
[0098] DieporösenTeilchen werden vorzugsweise durch Agglomeration von Primärteilchender Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt. Durch Verwendungsolcher poröserTeilchen kann die Oberfläche desBasiskörpers 11 nochzuverlässigerbeschichtet werden, da diese porösenTeilchen bei der Kollision mit dem Basiskörper 11 noch effizienterfragmentiert werden.
[0099] Diemittlere Teilchengröße der porösen Teilchenist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch vorzugsweisebei 100 μmoder weniger. Übersteigtdie mittlere Teilchengröße der porösen Teilchen100 μm,so ist möglicherweisedie Geschwindigkeit dieser Teilchen bei ihrer Kollision mit demBasiskörper 11 so gering,dass die porösenTeilchen nicht effizient fragmentiert werden.
[0100] DieKollision zwischen den Basiskörpern 11 undden porösenTeilchen erfolgt beispielsweise unter Verwendung eines handelsüblichenHybridisierungsgerätesim trockenen Zustand. Dabei beträgtbeispielsweise das Mischverhältniszwischen den Basiskörpern 11 undden porösenTeilchen etwa 400:1 bis 50:1 (gewichtsbezogen), und die Temperaturin dem Gerätist gleich oder kleiner als die Erweichungstemperatur des Harzmaterials,welches das Hauptmaterial des Hauptkörpers 11 bildet (üblicherweise80°C oderweniger).
[0101] SolcheporöseTeilchen könnenin bekannter Weise beispielsweise auch wie folgt hergestellt werden.
[0102] UmkörnigeSekundärteilchenzu erhalten, könnendie porösenTeilchen beispielsweise durch direktes Sprühtrocknen eines Breis (Schlämme) hergestelltwerden, der kristalline Teilchen (Primärteilchen) einer nach einembekannten Nassverfahren synthetisierten Calciumphosphat-basiertenVerbindung enthält.Alternativ könnensolche Sekundärteilchenhergestellt werden, indem ein Additiv wie ein die Viskosität einstellendesMittel, Teilchen einer organischen Verbindung, Fasern, die durchErhitzung verdampft werden können,oder dergleichen dem Brei zugegeben und der Brei anschließend sprühgetrocknetwird. Die so erhaltenen Sekundärteilchenkönnennach Bedarf auch gesintert werden.
[0103] Dadie so erhaltenen Sekundärteilchenporös sind,könnensie direkt zur Ausbildung der Deckschicht 12 verwendetwerden.
[0104] SindporöseTeilchen mit einer noch höherenPorositäterwünscht,so könnendiese Teilchen beispielsweise in folgender Weise hergestellt werden.
[0105] Zunächst wirdein Brei, in dem die oben beschriebenen Sekundärteilchen suspendiert sind,zubereitet und dieser Brei durch Nassformen, Trockenformen oderdergleichen in eine Blockform gebracht. Dem Brei kann auch eineorganische Verbindung zugegeben werden, die in dem folgenden Sinterprozessverdampft wird, um Poren auszubilden. Der Porendurchmesser kannauch an Stelle der Zugabe einer solchen organischen Verbindung durchEinstellen der Prozessbedingungen, wie z.B. der Sintertemperatur,kontrolliert werden. Anschließendwird der so erhaltene Block bei einer Temperatur im Bereich vonetwa 400 bis 1300°Cgesintert. Ist die Sintertemperatur kleiner als 400°C, so istzu befürchten,dass die organische Verbindung nicht vollständig verdampft oder der Blocknicht ausreichend gesintert wird. Wird dagegen der Sinterprozessbei einer Temperatur höherals 1300°Cdurchgeführt,so ist zu befürchten,dass der resultierende Sinterkörper übermäßig dichtwird oder sich die Calciumphosphat-basierte Verbindung zersetzt.
[0106] Anschließend wirdder so gesinterte Block zermahlen und klassifiziert, um Teilchenmit der gewünschtenTeilchengröße zu erhalten.
[0107] DerPorendurchmesser in dem porösenTeilchen kann beispielsweise dadurch eingestellt werden, dass dieGröße der Primärteilchen,die Viskositätdes Breis, die Art des Additivs oder dergleichen geeignet eingestelltwerden.
[0108] Dasso erhaltene poröseTeilchen hat vorzugsweise eine spezifische Oberfläche von10 m²/g oder mehr und einen Porendurchmesservon etwa 500 bis 1000 Å.Der Zellkulturträger 1A,der unter Verwendung der die oben beschriebenen Anforderungen erfüllendenporösenTeilchen hergestellt ist, ermöglichtes den Zellen, noch effizienter an seiner Oberfläche zu haften und zu wachsen.
[0109] DasVerfahren zum Herstellen der Deckschicht 12 und damit desZellkulturträgers 1A istnicht auf das oben beschriebene Verfahren beschränkt.
[0110] DieDeckschicht 12 kann dicht oder porös sein.
[0111] Diemittlere Dicke der Deckschicht 12 ist nicht auf einen bestimmtenWert beschränkt,liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 5 μm, noch besserim Bereich von etwa 0,5 bis 2 μm.Ist die mittlere Dicke der Deckschicht 12 kleiner als deroben angegebene untere Grenzwert, so ist zu befürchten, dass ein Teil der Oberfläche desBasiskörpers 11 indem Zellkulturträger 1A freiliegt. Übersteigtdagegen die mittlere Dicke der Deckschicht 12 den vorstehendangegebenen oberen Grenzwert, so wird es schwierig, die Dichte desZellkulturträgers 1A einzustellen.
[0112] DerZellkulturträger 1A hatvorzugsweise eine Dichte (spezifisches Gewicht), die nahe bei derDichte von Wasser liegt. Insbesondere liegt die Dichte des Zellkulturträgers 1A vorzugsweiseim Bereich von etwa 0,8 bis 1,4 g/m³, nochbesser im Bereich von etwa 0,9 bis 1,2 g/m³.Indem die Dichte des Zellkulturträgers 1A auf einenim vorstehend angegebenen Bereich liegenden Wert eingestellt wird,könnendie Zellkulturträger 1A nochgleichmäßiger ineiner Zellkulturlösungsuspendiert werden.
[0113] DieAbmessung des Zellkulturträgers 1A istnicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Sie ist jedoch vorzugsweisewie folgt festgelegt.
[0114] Istdie mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A alsA (μm) unddie maximale Längeeiner Zelle, die auf den Zellkulturträger 1A haften soll,als B (μm)definiert, so liegt das VerhältnisA/B vorzugsweise bei etwa 2 bis 100, noch besser bei etwa 5 bis50. Indem das VerhältnisA/B auf ein in dem vorstehenden Bereich liegenden Wert eingestelltwird, kann die Oberflächedes jeweiligen Zellkulturträgers 1A bezogenauf die Größe der Zelleausreichend vergrößert werden,was es den Zellen erlaubt, noch einfacher an der Oberfläche des Zellkulturträgers 1A zuhaften und zu wachsen.
[0115] Istdie mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A unddie mittlere Teilchengröße von später genauerbeschriebenen magnetischen Teilchen 2A als C (μm) definiert,so liegt das VerhältnisC/A vorzugsweise bei etwa 0,02 bis 10, noch besser bei etwa 0,3bis 3. Indem das VerhältnisC/A auf einen im vorstehenden Bereich liegenden Wert eingestelltwird, ist es möglich,eine Zellkulturlösungkraft der Bewegung der magnetischen Teilchen 2A in ausreichendemMaße zurühren(vergl. weiter unten), wodurch die Zellkulturträger 1A noch gleichmäßiger inder Zellkulturlösungsuspendiert werden können.
[0116] Diemittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A liegtvorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis 500 μm, noch besser im Bereich vonetwa 100 bis 300 μm.Indem die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A aufeinen im vorstehenden Bereich liegenden Wert eingestellt wird, können dieoben beschriebenen technischen Wirkungen weiter verbessert werden.
[0117] Umes einer großenZahl von Zellen zu ermöglichen,an der Oberflächedes oben beschriebenen Zellkulturträgers 1A zu haftenund zu wachsen, ist vorzugsweise weitgehend die gesamte Oberfläche desBasiskörpers 11 mitder Deckschicht 12 wie in dem vorliegenden Ausführungsbeispielbedeckt. Jedoch kann der Zellkulturträger 1A auch so aufgebautsein, dass in Abhängigkeitder Zellart, die auf dem Zellkulturträger 1A haften soll,der Art des den Basiskörper 11 bildendenMaterials oder dergleichen nur ein Teil der Oberfläche desBasiskörpers 11 mitder Deck schicht 12 bedeckt ist. Bei diesem Aufbau liegtalso ein Teil der Oberfläche desBasiskörpers 11 durchdie in der Deckschicht 12 ausgebildeten Lücken frei.
[0118] Diemagnetischen Teilchen 2A können in einer Zellkulturlösung durchAnwendung eines Magnetfeldes bewegt werden. Werden die magnetischenTeilchen 2A durch die gesamte Zellkulturlösung bewegt,so wird letztere gleichmäßig undsanft gerührt,was im Ergebnis dazu führt,dass die Zellkulturträger 1A gleichmäßig in derZellkulturlösungsuspendiert werden.
[0119] DieZellen könnendeshalb leicht an den Oberflächender Zellkulturträger 1A haftenund werden gleichmäßig mitNahrung versorgt. Außerdemkönnenmechanische Stöße auf dieZellkulturträger 1A vermieden werden,die in dem herkömmlichen,mit einer Schleuderflasche arbeitenden Verfahren infolge der Kollisioneiner Rührrippeund der Zellkulturträgerverursacht werden. Dadurch wird verhindert, dass die an den Zellkulturträgern 1A haftendenZellen von deren Oberflächenfallen. Außerdemwird eine Schädigungder Zellen vermieden. Die Erfindung sorgt demnach für ein nocheffizienteres Zellwachstum.
[0120] EinVorteil der Erfindung liegt darin, dass die magnetischen Teilchen 2A mitAnlegen eines Magnetfeldes leicht bewegt werden können undsich mit Beseitigung des Magnetfeldes in einer Zellkulturlösung nach untenabsetzen (abscheiden) können.Dadurch kann die Zellkulturlösungnoch einfacher und zuverlässigergerührtwerden.
[0121] Unterdiesem Gesichtspunkt liegt die Dichte (spezifisches Gewicht) dermagnetischen Teilchen 2A vorzugsweise im Bereich von etwa0,8 bis 2,5 g/cm³, noch besser im Bereichvon etwa 1,2 bis 1,9 g/cm³. Ist die Dichteder magnetischen Teilchen 2A zu gering, so setzen sie sichnach Beseitigung des Magnetfeldes nur schwer in der Zellkulturlösung nachunten ab. Ist dagegen die Dichte der magnetischen Teilchen 2A zuhoch, so wird ein starkes Magnetfeld benötigt, um die magnetischen Teilchen 2A inder Zellkulturlösungzu bewegen. In beiden Fällenbesteht die Befürchtung,dass die Zellkulturlösungnicht ausreichend gerührtwerden kann.
[0122] Dasmagnetische Teilchen 2A kann als Ganzes aus einem magnetischenMaterial bestehen. Vorzugsweise besteht es jedoch aus einem Komposit-oder Verbundmaterial, das man durch Mischen eines Harzmaterialsund eines magnetischen Materials erhält. Indem das Mischungsverhältnis zwischendem Harzmaterial und dem magnetischen Material geeignet eingestelltwird, kann die Dichte (spezifisches Gewicht) des magnetischen Teilchens 2A ineinfacher Weise eingestellt werden. Außerdem liegt ein Vorteil darin,dass Form und Größe (z.B.mittlere Teilchengröße) desmagnetischen Teilchens 2A einfach eingestellt werden können.
[0123] Wiein 3 gezeigt, hat dasmagnetische Teilchen (Komposit- oder Verbundteilchen) 2A vorzugsweiseeinen Aufbau, in dem ein magnetisches Material (magnetisches Pulver) 22 ineinem aus einem Harzmaterial bestehenden Basiskörper 21 dispergiert,d.h. verteilt ist. Solche magnetischen Teilchen 2A können vergleichsweiseeinfach hergestellt werden, indem beispielsweise das das magnetischeMaterial 22 enthaltende Harzmaterial im geschmolzenen Zustandin Teilchen geformt wird (Granulierung). In diesem Zusammenhangist darauf hinzuweisen, dass das in Form des Verbundteilchens vorliegendemagnetische Teilchen 2A auch einen Aufbau haben kann, indem das magnetische Material 22 nur in der Nähe der Oberfläche desBasiskörpers 21 dispergiertist.
[0124] Beispielefür dasmagnetische Material 22 sind eine ferromagnetische Legierung,die Eisenoxid, Fe, Li, Co oder dergleichen als Hauptbestandteilenthält,Ferrit, Bariumferrit, Strontiumferrit und dergleichen. Diese magnetischenMaterialien könnenallein oder in Kombination von zwei oder mehr Materialien verwendetwerden.
[0125] Für das Harzmaterialkann das gleiche Material wie das oben für den Basiskörper 11 desZellkulturträgers 1A beschriebeneMaterial verwendet werden.
[0126] Diemittlere Teilchengröße der magnetischenTeilchen 2A liegt vorzugsweise im Bereich von 10 bis 500 μm, noch besserim Bereich von etwa 100 bis 300 μm.Ist die mittlere Teilchengröße der magnetischenTeilchen 2A zu klein, so kann in der Zellkulturlösung eineturbulente Strömungnicht in ausreichendem Maßeerzeugt werden. Ist dagegen die mittlere Teilchengröße der magnetischenTeilchen 2A zu groß,so wird ein starkes Magnetfeld benötigt, um die magnetischen Teilchen 2A inder Zellkulturlösungzu bewegen. In beiden Fällenist zu befürchten,dass die Zellkulturlösungnicht ausreichend gerührtwerden kann. Außerdemist darauf hinzuweisen, dass bei einer zu geringen mittleren Teilchengröße der magnetischenTeilchen 2A die Befürchtungbesteht, dass die magnetischen Teilchen 2A leicht agglomerieren.
[0127] DieMenge an magnetischen Teilchen 2A, die der Zellkulturlösung zuzugebenwird, ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise werden jedochdie magnetischen Teilchen 2A in einer Menge zugegeben,in der das Mischverhältniszwischen den magnetischen Teilchen 2A und den Zellkulturträgern 1A im Bereichvon etwa 10:90 bis 50:50 (insbesondere etwa 20:80 bis 40:60) inVol.-% beträgt.Ist die der Zellkulturlösungzugegebene Menge an magnetischen Teilchen 2A zu klein,so ist zu befürchten,dass die Zellkulturlösungnicht ausreichend gerührtwerden kann. Ist dagegen die der Zellkulturlösung zugegebene Menge an magnetischenTeilchen zu groß,so besteht die Befürchtung,dass die Kollisionsfrequenz zwischen den magnetischen Teilchen 2A undden Zellkulturträgern 1A sostark zunimmt, dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern 1A lösen.
[0128] In 4 ist beispielhaft ein magnetischesTeilchen 2A mit einem modifizierten Aufbau gezeigt, beidem zumindest ein Teil der Oberfläche (in 4 weitgehend die gesamte Oberfläche) desmagnetischen Teilchens 2A mit einer Deckschicht 23 bedecktist, die eine Zellanhaftung ermöglicht.Das magnetische Teilchen 2A ermöglicht es Zellen, an seinerOberflächezu haften und zu wachsen. Dadurch wird die Effizienz des Zellwachstumsweiter verbessert.
[0129] DieDeckschicht 23 hat den gleichen Aufbau wie die Deckschicht 12 desZellkulturträgers 1A.Die Deckschicht 23 besteht also vorzugsweise hauptsächlich ausder Calciumphosphat-basierten Verbindung. Außerdem ist die Deckschicht 23 vorzugsweiseaus feinen Teilchen 24 gebildet, die hauptsächlich ausder Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen und teilweisein einen Oberflächenbereicheingebettet sind, der die Oberflächedes magnetischen Teilchens umfasst und an diese angrenzt. Die Deckschicht 23 wirdvorzugsweise in der Weise ausgebildet, dass poröse Teilchen, die hauptsächlich ausder Calciumphosphat-basierten Verbindungbestehen, mit der Oberflächedes magnetischen Teilchens 2A in Kollision gebracht werden.
[0130] Wirddie Deckschicht 23 unter Verwendung der Calciumphosphat-basiertenVerbindung als Hauptmaterial hergestellt, so fängt sie von dem magnetischenMaterial 22 erzeugte Metallionen ein und verhindert so dieEluierung dieser Metallionen in die Zellkulturlösung. Dadurch wird ein nachteiligerEinfluss auf die Zellen vermieden. Die Deckschicht 23 bildetalso in diesem Fall eine Ionensperrschicht.
[0131] Inden Verfahren zur Zellkultivierung nach erstem und zweitem Ausführungsbeispielkann die gleiche Zellkulturlösungeingesetzt werden. Dabei wird eine Zellkulturlösung 140 in Abhängigkeitbeispielsweise der zu verwendenden Zellart geeignet ausgewählt undsie ist nicht auf eine bestimmte Lösung beschränkt. Beispiele für eine verwendbareZellkulturlösungsind Dulbecco'sMEM, Nissui MEM, BME, MCDB-104 Medium und dergleichen.
[0132] DieZellkulturlösung 140 enthält beispielsweiseSerum, Serumprotein wie Albumin sowie nach Bedarf Zusätze wiez.B. verschiedenartige Vitamine, Aminosäure und Salze.
[0133] ImFolgenden wird unter Bezugnahme auf die 5 bis 9 eineEinrichtung zur Zellkultivierung beschrieben, die in den oben erläutertenVerfahren zur Zellkultivierung nach erstem und zweitem Ausführungsbeispielverwendet werden kann.
[0134] ImFolgenden wird ein erstes Ausführungsbeispielder Zellkultivierungseinrichtung beschrieben.
[0135] 5 zeigt in einer schematischen,perspektivischen Darstellung eine Zellkultivierungseinrichtung 100 nachdem ersten Ausführungsbeispiel. 6 ist ein Zeitdiagramm,welches das Muster eines Magnetfeldes zeigt, das ein Magnetfeldgenerator 120 derZellkultureinrichtung 100 erzeugt.
[0136] DieZellkultivierungseinrichtung 100 nach 5 umfasst ein Kultivierungsgefäß 110,den vorstehend genannten Magnetfeldgenerator 120, eineSteuerung 130, und eine Heizvorrichtung 150. DieSteuerung 130 ist an eine Stromquelle ange schlossen, ausder elektrische Energie zugeführtwird, die zum Betrieb der einzelnen Komponenten der Kultivierungseinrichtung 100 erforderlichist.
[0137] DasKultivierungsgefäß 100 bildeteine Komponente zur Aufnahme der Zellkulturlösung 140 und hat anseinem oberen Teil eine Öffnung 111,durch welche die Zellkulturlösung 104 eingebrachtund entnommen wird. Die Öffnung 111 wirdnach Bedarf mit einem Stöpsel 112 verschlossen,um die Luftdichtigkeit innerhalb des Kultivierungsbehälters 110 zugewährleisten.
[0138] Form,Fassungsvermögensowie weitere Eigenschaften des Kultivierungsbehälters 110 unterliegen keinenbesonderen Beschränkungenund werden je nach der zu verwendenden Zellart, der Art der Zellkulturlösung 140 unddergleichen geeignet festgelegt.
[0139] DerMagnetfeldgenerator 120 bildet eine Komponente zum Erzeugeneines Magnetfeldes, um die in dem Zellkultivierungsverfahren nacherstem Ausführungsbeispielverwendeten Zellkulturträger 1 oderdie in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispielverwendeten magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 zubewegen. Der Magnetfeldgenerator 120 hat einen Elektromagneten 121 undeine nicht-magnetische Abdeckung (nicht gezeigt), in der der Elektromagnet 121 aufgenommenist.
[0140] Indem vorliegenden Ausführungsbeispielbesteht der Elektromagnet 121 aus einem ringförmigen,metallischen Kernmaterial 122 und einem Leiter 123,der spiralig um die Außenfläche desKernmaterials 122 gewickelt ist. Der elektrische Stromflussdurch die Leiter 123 erzeugt ein Magnetfeld in der Nähe des Leiters 123.
[0141] Dienicht-magnetische Abdeckung dient dem Schutz und der Fixierung desElektromagneten 121 und kann aus verschiedenartigen Harzmaterialienbestehen, z.B. einem Acryl-basierten Harz oder einem Silikon-basiertenHarz.
[0142] DasKultivierungsgefäß 110 befindetsich innerhalb des Magnetfeldgenerators 120. Dabei umgibtder Magnetfeldgenerator 120 die Außenfläche des Kultivierungsgefäßes 110.Der Magnetfeldgenerator 120 ist über ein nicht gezeigtes Befestigungselementfixiert und gehalten. Der Magnetfeldgenerator 120 befindetsich in vertikaler Richtung des Kultivierungsgefäßes 110 vorzugsweisein einer Höhenahe der Oberflächeder Zellkulturlösung 140,wenn diese in dem Kultivierungsgefäß 110 gespeichert(aufgenommen) ist. Indem die Position des Magnetfeldgenerators 120 aufeine solche Höheeingestellt wird, könnendie Zellkulturträger 1 oder diemagnetischen Teilchen 2A in vertikaler Richtung weitläufig bewegtwerden, so dass die Zellkulturlösung 140 besondersgleichmäßig umgerührt werdenkann.
[0143] DerAbstand zwischen dem Magnetfeldgenerator 120 und dem Kultivierungsgefäß 110,der in 5 mit d bezeichnet ist, unterliegt keiner besonderenEinschränkung.Vorzugsweise ist jedoch der Magnetfeldgenerator 120 sonah wie möglichan dem Kultivierungsgefäß 110 angeordnet.Dabei sind die genannten Komponenten vorzugsweise so angeordnet,dass sie in (engen) Kontakt miteinander kommen.
[0144] DerMagnetfeldgenerator 120 ist so ausgebildet, dass er dieIntensitätdes erzeugten Magnetfeldes mit der Zeit ändern kann. Ein Beispiel für das Mustereines durch den Magnetfeldgenerator 120 zu erzeugenden Magnetfeldesist in 6(a) gezeigt,wo das Magnetfeld in regelmäßigen Intervallenintermittierend erzeugt wird. Mit Erzeugen eines Magnetfeldes werdendie Zellkulturträger 1 oderdie magnetischen Teilchen 2A zur Seite des Magnetfeldgenerators 120 hinangezogen, so dass die Zellkulturträger 1 oder die magnetischenTeilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 aufsteigen.In diesem Zustand wird die Magnetfelderzeugung gestoppt, so dasssich die Zellkulturträger 1 oderdie magnetischen Teilchen 2A, die zur Seite des Magnetfeldgenerators 120 hinangezogen worden sind, unter ihrem Eigengewicht absetzen. Indemwiederholt eine solche vertikale Bewegung der Zellkulturträger 1 oderder magnetischen Teilchen 2A bewirkt wird, wird eine turbulenteStrömungin der Zellkulturlösung 140 erzeugt,so dass die Zellkulturlösung 140 gleichmäßig undsanft umgerührt wird.
[0145] DieMaximalintensität(Absolutwert) des Magnetfeldes wird in Abhängigkeit der Dichte (spezifisches Gewicht)des jeweiligen Zellkulturträgers 1 oderdes magnetischen Teilchens 2A, in Abhängigkeit der Zusammensetzungund des Volumens der Zellkulturlösung 140 unddergleichen geeignet festgelegt. Sie ist nicht auf einen bestimmtenWert beschränkt,liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 100 Wb/m², noch besser im Bereich von etwa 0,2 bis50 Wb/m². Ist die Maximalintensität des magnetischenFeldes (magnetische Flussdichte) zu gering, so ist zu befürchten,dass die Zellkulturträger 1 oderdie magnetischen Teilchen 2A nicht ausreichend zur Seitedes Magnetfeldgenerators 120 hin angezogen werden, so dassdie Zellkulturlösung 140 nichtausreichend umgerührtwird. Liegt dagegen die Maximalintensität des Magnetfeldes über demvorstehend genannten oberen Grenzwert, so ist zu befürchten,dass das Magnetfeld möglicherweiseeinen schädlichenEinfluss auf die Zellen hat. Außerdemwird elektrische Energie vergeudet.
[0146] DasMuster des Magnetfeldes, das der Magnetfeldgenerator 120 erzeugt,ist nicht auf das in 6(a) gezeigteMuster beschränkt,nach dem das Magnetfeld intermittierend in regelmäßigen Intervallenerzeugt wird. Verwendbar sind beispielsweise auch ein Muster, beidem die Intensitätdes zu erzeugenden Magnetfeldes nach 6(b) inregelmäßigen Intervallenerhöhtund verringert wird, ein Muster, bei dem beispielsweise die Intensität, die Richtungoder dergleichen des zu erzeugenden Magnetfeldes nach 6(c) kontinuierlich geändert werden,oder andere Muster. Diese Muster können nach Wunsch miteinanderkombiniert werden.
[0147] DieSteuerung 130 hat die Funktion, die Zustände (z.B.Art, Stärke,Richtung, Zeit, Frequenz, etc.) des von der Stromquelle zugeführten elektrischenStroms zu ändern.Die Steuerung 130 wandelt den von der Stromquelle zugeführten elektrischenStrom in einen Strom, der vorbestimmte Bedingungen erfüllt (elektrischer Strommit einem vorbestimmten Muster), und führt diesen gewandelten elektrischenStrom dem Elektromagneten 121 des Magnetfeldgenerators 120 zu.Erzeugt beispielsweise der Magnetfeldgenerator 120 das Magnetfeldintermittierend, so wandelt die Steuerung 120 einen vonder Stromquelle zugeführtenWechselstrom in einen gepulsten Strom und führt diesen gepulsten Stromdem Elektromagneten 121 zu.
[0148] DieHeizvorrichtung 150 ist elektrisch mit der Steuerung 130 verbunden.Die Heizvorrichtung 150 umfasst beispielsweise eine Heizung,ein Pettier-Element oder dergleichen und erhitzt die Zellkulturlösung 140 unterder Kontrolle der Steuerung 130.
[0149] ImFolgenden wird die Funktionsweise der Zellkultivierungseinrichtung 100,d.h. das mit dieser Einrichtung arbeitende Zellkultivierungsverfahren,beschrieben.
[0150] <1> Zunächst werdendie Zellkulturträger 1 (indem Zellkultivierungsverfahren nach erstem Ausführungsbeispiel) oder die Zellkulturträger 1A unddie magnetischen Teilchen 2A (in den Zellkultivierungsverfahrennach zweitem Ausführungsbeispiel)einer Sterilisierung unterzogen. Dadurch werden Mikroorganismen oderSchimmelpilze, die auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls den magnetischen Teilchen 2A vorhanden sind,in ihrer Zahl reduziert oder sogar vollständig abgetötet. Die Gefahr, dass Mikroorganismenoder Schimmelpilze die Zellen schädigen, ist so verringert odergar ausgeschlossen, wodurch ein besonders effizientes Zellwachstummöglichwird.
[0151] ZurSterilisierung wird beispielsweise ein Verfahren, in dem die Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in Kontaktmit sterilisierenden Lösungengebracht werden, eine Autoklav-Sterilisierung, eine Gas-Sterilisierung, eineStrahlungs-Sterilisierung oder dergleichen angewandt. Unter diesenVerfahren ist das Verfahren, bei dem die Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in Kontaktmit einer sterilisierenden Lösunggebracht werden, besonders geeignet. Mit einem solchen Verfahrenist es nämlichmöglich,eine großeZahl an Zellkulturträgern 1, 1A undgegebenenfalls magnetischen Teilchen 2A wirksam zu sterilisieren.
[0152] BeiAnwendung einer sterilisierenden Lösung werden die Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A nach der Sterilisierunggewaschen, um die sterilisierende Lösung, die an den Oberflächen derZellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls der magnetischen Teilchen 2A haften, zuentfernen.
[0153] <2> Nach Abschluss desoben beschriebenen Prozesses <1> werden die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfallsdie magnetischen Teilchen 2A sowie Zellen (die an den Trägern 1A undden magnetischen Teilchen 2A haften sollen) der Zellkulturlösung 140 zugegebenoder zugemischt. Die so erhaltene Zellkulturlösung 140 wird anschließend indas Kultivierungsgefäß 110 derZellkultivierungseinrichtung 100 eingebracht.
[0154] ImVorfeld wurde beispielsweise ein Shuttle-Vektor (Vektor), der einein Zielprotein-codierendes Gen enthält, in jede Zelle eingebracht.
[0155] Beispielefür dieverwendete Zelle sind eine Tierzelle, eine Pflanzenzelle, ein Bakteriumund ein Virus. Von diesen Zellen ist eine Tierzelle besonders geeignet.Die Verwendung einer Tierzelle ermöglicht die Anwendung der Erfindungin weiten technischen Gebieten. Soll außerdem ein Protein erzeugtwerden, so kann eines mit einer komplexeren Struktur (z.B. Glykoprotein)hergestellt werden.
[0156] <3> Wie oben beschrieben,beaufschlagt der Magnetfeldgenerator die Zellkulturlösung 140 beiInbetriebnahme der Zellkultivierungseinrichtung 100 miteinem Magnetfeld, das ein vorbestimmtes Muster aufweist. Dadurchwerden die Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 bewegtund durch diese Bewegung die Zellkulturlösung 140 umgerührt, sodass die Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A gleichmäßig in derZellkulturlösungsuspendiert werden.
[0157] DieZellkulturlösung 140 wirddabei mit der Heizvorrichtung 150 erwärmt. Die Temperatur der Zellkulturlösung 140 wirdbeispielsweise in Abhängigkeitder zu kultivierenden Zellart etc. geeignet festgelegt und ist nichtauf einen bestimmten Wert beschränkt. Üblicherweiseliegt die Temperatur im Bereich von etwa 4 bis 40°C, noch besserim Bereich von etwa 25 bis 37°C.
[0158] Untersolchen Bedingungen haften die Zellen an den Oberflächen derZellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls der magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140.Da die Zellkulturlösung 140 durchdie Bewegung der magnetischen Teilchen 2A gleichmäßig undsanft gerührtwird, könnendie Zellen mit hoher Effizienz kultiviert werden.
[0159] Diegewachsenen Zellen erzeugen dann ein Zielprotein. Dieses Proteinwird beispielsweise in die Zellkulturlösung 140 freigesetztoder in den Zellen gesammelt.
[0160] DieZellkultivierung kann nach Bedarf unter Zufuhr eines Sauerstoffenthaltenden Gases durchgeführt werden.
[0161] <4> Das erzeugte Proteinwird anschließendgesammelt. Wird das Protein in die Zellkulturlösung 140 freigesetzt,so kann es beispielsweise folgendermaßen gesammelt werden.
[0162] Inobigem Prozess <3> wird das Rühren derZellkulturlösung 140 gestopptund dann ein Überstand gesammelt,nachdem sich die Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 nachunten abgesetzt haben. Alternativ kann die Zellkulturlösung 140 gefiltertwerden, um so das resultierende Filtrat zu sammeln. Die gesammelteLösung(Überstandoder Filtrat) wird dann in vorbestimmter Weise behandelt (z.B. Chromatografie),wodurch das Zielprotein in einfacher Weise gesammelt werden kann.
[0163] ImFolgenden wird eine Zellkultivierungseinrichtung nach einem zweitenAusführungsbeispielbeschrieben.
[0164] 7 ist eine schematische,perspektivische Darstellung der Zellkultivierungseinrichtung 100 nach zweitemAusführungsbeispiel.
[0165] Daszweite Ausführungsbeispielwird im Folgenden im Hinblick auf seine Unterschiede gegenüber demersten Ausführungsbeispielbeschrieben. ÜbereinstimmendeMerkmale werden nicht nochmals beschrieben.
[0166] DieZellkultivierungseinrichtung 100 nach 7 und die Zellkultivierungseinrichtung 100 nacherstem Ausführungsbeispielsind abgesehen vom Aufbau des Magnetfeldgenerators 120 gleich.
[0167] DerMagnetfeldgenerator 120 nach zweitem Ausführungsbeispielumfasst den Elektromagneten 121, der dadurch gebildet ist,dass der Leiter 123 spiralig um die Außenfläche eines geraden (zylindrischen)Kernmaterials 122 gewickelt ist. Der Magnetfeldgenerator 120 istvorzugsweise mit einer wasserfesten Abdeckung bedeckt, die hauptsächlich auseinem Material besteht, das ein Magnetfeld unbeeinflusst lässt.
[0168] DerMagnetfeldgenerator 120 wird dadurch fixiert, dass er durchden an dem Kultivierungsgefäß 110 anzubringendenStöpsel 112 geführt wird.In diesem Ausführungsbeispielist der Magnetfeldgenerator 120 so angeordnet, dass ersich währendder Zellkultivierung in Kontakt mit der Zellkulturlösung 140 befindet.
[0169] DasMuster des von dem Magnetfeldgenerator 120 zu erzeugendenMagnetfeldes kann beispielsweise eines der in 6 gezeigten, oben beschriebenen Mustersein.
[0170] DieZellkultivierungseinrichtung 100 nach zweitem Ausführungsbeispielweist die gleiche Funktion und Wirkung wie die des ersten Ausführungsbeispielsauf.
[0171] ImFolgenden wird eine Zellkultivierungseinrichtung 100 nacheinem dritten Ausführungsbeispielbeschrieben.
[0172] 8 ist eine schematische,perspektivische Darstellung, welche die Zellkultivierungseinrichtung 100 nachdrittem Ausführungsbeispielzeigt. 9 ist ein Zeitdiagramm,welches die Muster eines von dem Magnetfeldgenerator 120 zuerzeugenden Magnetfeldes zeigt.
[0173] Dasdritte Ausführungsbeispielwird im Folgenden im Hinblick auf seine Unterschiede gegenüber dem erstenAusführungsbeispielbeschrieben. ÜbereinstimmendeMerkmale werden deshalb nicht nochmals beschrieben.
[0174] DieZellkultivierungseinrichtung 100 nach 8 und die Zellkultivierungseinrichtung 100 nacherstem Ausführungsbeispielsind abgesehen vom Aufbau des Magnetfeldgenerators 120 gleich.
[0175] DerMagnetfeldgenerator 120 nach drittem Ausführungsbeispiel hat mehrere,z.B. vier Elektromagnete 121A bis 121D.
[0176] DieElektromagnete 121A bis 121D sind in Umfangsrichtungdes Kultivierungsgefäßes 110 inetwa gleichen Abständenvoneinander angeordnet.
[0177] DieserAufbau ermöglichtes durch sukzessives Umschalten unter den elektrisch zu speisendenElektromagneten 121A bis 121D, d.h. durch Ändern derAnordnung des zu erzeugenden Magnetfeldes mit der Zeit, das Bewegungsmusterder Zellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls der magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 komplizierterzu gestalten. Dadurch könnendie Zellkulturträ ger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A noch gleichmäßiger inder Zellkulturlösung 140 suspendiertwerden, was im Ergebnis zu einem noch effizienteren Zellwachstumführt.
[0178] EinBeispiel fürdas Muster des durch die einzelnen Elektromagneten 121A bis 121D erzeugtenMagnetfeldes (Umschalten zwischen den elektrisch zu speisenden Elektromagneten 121A bis 121D)ist in 9 gezeigt. Dabeierzeugt eines der Elektromagneten ein Magnetfeld, während dieanderen Elektromagneten gerade kein Magnetfeld erzeugen. Die Umschaltungunter den Elektromagneten erfolgt in der Weise, dass ein Magnetfeldsukzessive (synchron) erzeugt wird. Dadurch ist es möglich, dieZellkulturträger 1, 1A undgegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A entlang derInnenflächedes Kultivierungsgefäßes 110 zubewegen. Das Muster des von den Elektromagneten 121A bis 121D zuerzeugenden Magnetfeldes ist nicht auf das in 9 gezeigte Muster beschränkt. Eskann beispielsweise auch ein Muster zur Anwendung kommen, das sich durchwahlweises Kombinieren der in 6 gezeigtenMuster ergibt.
[0179] DieElektromagnete 121A bis 121D können, was beispielsweise dieWindungszahl des Leiters 123, ihre Gesamtform oder ihreGesamtgröße betrifft,untereinander gleich oder aber verschieden voneinander ausgebildetsein.
[0180] DieZellkultivierungseinrichtung 100 nach drittem Ausführungsbeispielweist die gleiche Funktion und technische Wirkung wie die des erstenAusführungsbeispielsauf.
[0181] DieErfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Zellkultivierungseinrichtungenbeschränkt,so lange die Einrichtungen die beabsichtigen Funktionen erzielen.An diesen Einrichtungen könnenverschiedenartige Änderungenund Ergänzungenvorgenommen werden. Außerdemkönnendie Merkmale von zwei oder mehreren der oben beschriebenen Ausführungsbeispielenach Belieben miteinander kombiniert werden.
[0182] Inden oben beschriebenen Ausführungsbeispielenist jeweils der Magnetfeldgenerator fixiert. Der Magnetfeldgeneratorund das Kultivierungsgefäß können jedochauch relativ zueinander bewegbar sein, um die Anordnung des aufdie Zellkulturlösungwirkenden Magnetfeldes mit der Zeit zu ändern. Beispielsweise kann derMagnetfeldgenerator gegenüberdem Kultivierungsgefäß in vertikaleroder horizontaler Richtung bewegt werden. Er kann auch auf das Kultivierungsgefäß zu odervon diesem weg oder aber entlang dessen Umfangsrichtung bewegt werden.Auch könnendiese Bewegungen des Magnetfeldes miteinander kombiniert werden.
[0183] Außerdem kanndie Erfindung vorsehen, dass der Magnetfeldgenerator die Intensität des aufdie Zellkulturlösunganzuwendenden Magnetfeldes zeitlich gemäß den oben beschriebenen Mustern ändert, während errelativ zu dem Kultivierungsgefäß bewegtwird, um auch die Anordnung des auf die Zellkulturlösung anzuwendendenMagnetfeldes zeitlich zu ändern.
[0184] Inden Ausführungsbeispielenumfasst der Magnetfeldgenerator den Elektromagneten. An Stelle des Elektromagnetenkönnenjedoch auch Permanentmagnete verwendet werden. In diesem Fall istder Magnetfeldgenerator zusätzlichmit einem Verstellmechanismus ausgestattet, um die Permanentmagneterelativ zu dem Kultivierungsgefäß zu bewegen,so dass die Zellkulturträgerund/oder die magnetischen Teilchen infolge der Bewegung der Permanentmagnetein der Zellkulturlösungbewegt werden. Die Permanentmagnete können dabei in unterschiedlichenRichtungen bewegt werden. z.B. nach oben und nach unten, nach rechtsund nach links, schrägund in Umfangsrichtung sowie in einer beliebigen Kombination dieserRichtungen.
[0185] Außerdem können inden oben beschriebenen Zellkultivierungsverfahren nach erstem undzweitem Ausführungsbeispielauch andere Zellkulturträgerzusammen mit den oben beschriebenen Zellkulturträgern verwendet werden. Solcheandere Zellkulturträgersind beispielsweise Träger,die aus einem Material bestehen, das als Hauptbestandteil Polystyrol,Polyacrylamid, Cellulose, Dextran und derglei chen enthält, undTräger,die jeweils aus einem hauptsächlichaus einem Harzmaterial bestehenden Basiskörper und einer Deckschichtgebildet sind, welche die Oberflächedes Basiskörpersbedeckt und aus einem Material besteht, das eine Zellanhaftung ermöglicht.
[0186] ImFolgenden werden praktische Beispiele für die Zellkultivierungsverfahrennach erstem und zweitem Ausführungsbeispielbeschrieben.
[0187] Zunächst wurden50 g Nylon-Teilchen (Basiskörper)mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 150 μm und einer Dichte von 1,90g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatit-Teilchen(durch Agglomeration von Primärteilchenerhaltene poröseTeilchen) mit einem Ca/P-Verhältnisvon 1,67 und einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 μm zubereitet.
[0188] DieHydroxylapatit-Teilchen hatten jeweils eine spezifische Oberfläche von45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
[0189] Anschließend wurdendie Nylon-Teilchen und die Hydroxylapatit-Teilchen in ein Systemmit der Bezeichnung NARA HYBRIDIZATION SYSTEM NHS-1 (von Nara MachineryCo., Ltd., Nennleistung 5,5 kW, Nennstrom 23 A) eingebracht. DiesesSystem wurde 5 Minuten mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben.Auf diese Weise wurden mit Hydroxylapatit bedeckte Zellkulturträger I-Amit dem in 1 gezeigtenAufbau hergestellt.
[0190] Dieso hergestellten ZellkulturträgerI-A hatten eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschichtaus Hydroxylapatit betrug 1 μm)und eine Dichte von 1,92 g/cm³.
[0191] Zunächst wurden50 g Nylon-Teilchen (Basiskörper)mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einerDichte von 1,02 g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatit-Teilchen (durch Agglomerationvon Primärteilchenerhaltene poröseTeilchen) mit einem Ca/P-Verhältnisvon 1,67 und einer mittleren Teilchengröße von 10 μm zubereitet.
[0192] DieHydroxylapatit-Teilchen hatten jeweils eine spezifische Oberfläche von45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
[0193] Anschließend wurdendie Nylon-Teilchen und die Hydroxylapatit-Teilchen in das SystemNARA HYBRIDISATION SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung5,5 kW, Nennstrom 23 A) eingebracht. Anschließend wurde dieses System 5Minuten mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben. Auf diese Weisewurden mit Hydroxylapatit beschichtete Zellkulturträger I-Bmit dem in 1 gezeigtenAufbau hergestellt.
[0194] Dieso hergestellten ZellkulturträgerI-B hatten eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschichtaus Hydroxylapatit betrug 1 μm)und eine Dichte von 1,03 g/cm³.
[0195] Eswurden Dextran-Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 200 μm und einerDichte von 1,03 g/cm³ (gefertigt von Pharmacia)als ZellkulturträgerI-C bereitgestellt.
[0196] Dieseaus dem menschlichen Osteosarkom abgeleitete Zelle hat eine maximaleLänge vonetwa 20 μm.
[0197] 1,5g der ZellkulturträgerI-A und 30 mL einer Suspension, die 2 × 10⁵ ausmenschlichem Osteosarkom (HOS) abgeleitete Zellen je Milliliter(/mL) enthielt, wurden einer Menge von 100 mL einer Zellkulturlösung mit derBezeichnung Nissui MEM zugegeben. Es ist darauf hinzuweisen, dass10 Vol.-% fötalesRinderserum der ZellkulturlösungNissui MEM zugegeben wurden.
[0198] DieseZellkulturlösungwurde in ein Kultivierungsgefäß (hitzebeständiges Glasgefäß von IWAKI-PYREX)einer Zellkultivierungseinrichtung nach 5 eingebracht, worauf die Zellkultivierungerfolgte. Als Kultivierungsbedingungen wurden das in 6(a) gezeigte Muster derMagnetfelderzeugung, ein Impulsintervall von 2 Sekunden, eine Temperaturder Zellkulturlösungvon 37°Cund ein Kultivierungszeitraum von 5 Tagen festgelegt.
[0199] DieZellkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel Ia-1 vorgenommen,abgesehen davon, dass das Impulsintervall auf 10 Sekunden geändert wurde.
[0200] DieZellkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel Ia-1 vorgenommen,abgesehen davon, dass die 1,5 g der Zellkulturträger I-A durch 0,6 g der Zellkulturträger I-Aund 0,8 g der ZellkulturträgerI-B ersetzt wurden.
[0201] DieZellkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel Ia-1 vorgenommen,abgesehen davon, dass die 1,5 g der Zellkulturträger I-A durch 0,6 g der Zellkulturträger I-Aum 0,8 g der ZellkulturträgerI-C ersetzt wurden.
[0202] Eswurden 1,5 g der ZellkulturträgerI-B und 30 mL einer Suspension, die 2 × 10⁵ Zellen,abgeleitet aus menschlichem Osteosarkom (HOS), je mL (/mL) enthielt,einer Menge von 100 mL der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben.Dabei wurden 10 Vol-% fötalesRinderserum der ZellkulturlösungNissui MEM zugegeben.
[0203] DieseZellkulturlösungwurde in eine Schleuderflasche (von Shibata Scientific TechnologyLtd.) eingebracht, worauf die Zellkultivierung erfolgte. Als Kultivierungsbedingungenwurden eine Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers von 30 U/min, eineTemperatur der Zellkulturlösungvon 37°Cund ein Kultivierungszeitraum von 5 Tagen festgelegt.
[0204] Eswurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in VergleichsbeispielIa-1 durchgeführt,abgesehen davon, dass die Rotationsgeschwindigkeit des Rührankersauf 60 U/min geändertwurde.
[0205] Eswurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in VergleichsbeispielIa-1 durchgeführt,abgesehen davon, dass die Zellkulturträger I-B durch die z Kontaktflächen 1-Cersetzt wurden.
[0206] DieseZelle ist aus einer Affenniere abgeleitet und hat eine maximaleLänge vonetwa 20 μm.
[0207] DieZellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in den VergleichsbeispielenIa-1 bis Ia-4 und in den Vergleichsbeispielen Ia-1 bis Ia-3, abgesehendavon, dass die aus dem menschlichen Osteosarkom abgeleiteten Zellendurch die aus einer Affenniere abgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
[0208] Diesevon einer Steckmücke(Moskito) abgeleitete Zelle hat eine maximale Länge von etwa 20 um.
[0209] DieZellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in den BeispielenIa-1 bis Ia-4 und den Vergleichbeispielen Ia-1 bis Ia-3, abgesehendavon, dass die aus dem menschlichen Osteosarkom abgeleiteten Zellen durchdie aus einer Stechmückeabgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
[0210] Injedem der Beispiele sowie der Vergleichsbeispiele wurde eine vorbestimmteMenge der Zellkulturlösungnach 3 Stunden, 1 Tag, 3 Tagen und 5 Tagen seit Beginn der Kultivierung(Rührbeginn)als Probe entnommen und die Zahl der Zellen ermittelt, die an denOberflächender Zellkulturträger(15 mg) hafteten. Die Zellen wurden gezählt, indem die mit EDTA oderTrypsin behandelten Zellen mit Trypanblau verfärbt wurden.
[0211] DieErgebnisse sind in den Tabellen 1 bis 3 angegeben.
[0212] Wieaus den Tabellen hervorgeht, weisen alle erfindungsgemäßen Beispieleungeachtet der Zellart eine höherZellkultivierungseffizienz als die Vergleichsbeispiele auf.
[0213] Aucheine Änderungdes Impulsintervalls des auf die Magnetfelderzeugung bezogenen Mustersführte inden erfindungsgemäßen Beispielenzu keiner besonders großenVariation der Zellwachstumseffizienz. Daraus wird deutlich, dasses nicht erforderlich ist, die Kultivierungsbedingungen in Abhängigkeitbeispielsweise der Zellart in den erfindungsgemäßen Beispielen streng genaueinzustellen.
[0214] Dagegenzeigten die Vergleichsbeispiele, in denen zur Kultivierung eineSchleuderflasche verwendet wurde, in Abhängigkeit der Rotationsgeschwindigkeitdes Rührankerseine großeVariation der Zellkultivierungseffizienz. In den Vergleichsbeispielenvariierte also der Zustand des Zellwachstums ungeachtet der Zellartin Abhängigkeitder Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers stark. Daraus gehthervor, dass die Optimierung der Kultivierungsbedingungen äußerst schwierigist. Außerdemstellte sich in den Vergleichsbeispielen heraus, dass sich die Zellenvon den Zellkulturträgernlösten.
[0215] Diein den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Beispielen vorgenommenenZellkultivierungen wurden auch unter Verwendung der Zellkultivierungseinrichtungennach den 5, 7 und 8 sowie unter Variation des Magnetfeldmustersdurchgeführt.Die Ergebnisse waren die gleichen wie die oben beschriebenen.
[0216] Zunächst wurden50 g Nylon-Teilchen (Basiskörper)mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einerDichte von 1,02 g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatitteilchen(durch Agglomeration von Primärteilchenerzeugte poröseTeilchen) mit einem Ca/P-Verhältnisvon 1,67 und einer mittleren Teilchengröße von 10 μm zubereitet.
[0217] DieHydroxylapatitteilchen hatten jeweils eine spezifische Oberfläche von45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
[0218] Anschließend wurdendie Nylon-Teilchen und die Hydroxylapatitteilchen in das Systemmit der Bezeichnung NARA HYBRIDIZATION SYSTEM NHS-1 (von Nara MachineryCo., Ltd., Nennleistung von 5,5 kW, Nennstrom 23A) eingebracht.Das System wurde dann 5 Minuten mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben. Aufdiese Weise wurden mit Hydroxylapatit versehene Zellkulturträger II-Amit dem in 2 gezeigtenAufbau hergestellt.
[0219] Derso hergestellte ZellkulturträgerII-A hatte eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschichtaus Hydroxylapatit betrug 1 μm)und eine Dichte von 1,03 g/cm³.
[0220] Eswurden Dextran-Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 200 μm und einerDichte von 1,03 g/cm³ (gefertigt von Pharmacia)als Zellkulturteilchen II-B zubereitet.
[0221] Eswurden Nylon-Teilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von150 μm undeiner Dichte von 1,02 g/cm³ als Zellkulturträger II-Czubereitet.
[0222] Eswurden Ferrit/Nylon-Verbundteilchen mit dem in 3 gezeigten Aufbau sowie mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einerDichte von 1,90 g/cm³ als magnetischen TeilchenII-A zubereitet.
[0223] Zunächst wurden50 g Ferrit/Nylon-Verbundteilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einerDichte von 1,90 g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatitteilchen(durch Agglomeration von Primärteilchenerhaltene poröseTeilchen) mit einem Ca/P-Verhältnisvon 1,67 und einer mittleren Teilchengröße von 10 μm zubereitet.
[0224] DieHydroxylapatitteilchen hatten eine spezifische Oberfläche von45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
[0225] Anschließend wurdendie Ferrit/Nylon-Verbundteilchen und die Hydroxylapatitteilchenin das System mit der Bezeichnung NARA HYBRIDISATION SYSTEM NHS-1 (von Nara MachineryCo., Ltd., Nennleistung 5,5 kW, Nennstrom 23 A) eingebracht. DiesesSystem wurde dann 5 Stunden mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben.Auf diese Weise wurden mit Hydroxylapatit beschichtete magnetischenTeilchen II-B hergestellt.
[0226] Dieso hergestellten magnetischen Teilchen II-B hatten eine mittlereTeilchengröße von 151 μm (die mittlereDicke der Deckschicht aus Hydroxylapatit betrug 1,0 μm) und eineDichte von 1,93 g/cm³.
[0227] Dieseaus menschlichem Osteosarkom abgeleitete Zelle hat eine Maximallänge vonetwa 20 μm.
[0228] Eswurden 0,8 g der ZellkulturträgerII-A, 0,6 g der magnetischen Teilchen II-A sowie 30 mL einer Suspension,die je Milliliter (/mL) 2 × 10⁵ aus menschlichem Osteosarkom (HOS) abgeleiteteZellen enthielt, einer Menge von 100 mL der Zellkulturlösung NissuiMEM zugegeben. Dabei wurden auch 10 Vol.-% fötales Rinderserum der Zellkulturlösung NissuiMEM zugegeben. Das Volumenverhältniszwischen den ZellkulturträgerII-A und den magnetischen Teilchen II-A betrug 70:30.
[0229] DieseZellkulturlösungwurde in ein Kultivierungsgefäß (wärmebeständiges Glasgefäß von IWAKI-PYREX)einer Zellkultivierungseinrichtung nach 5 eingebracht, worauf die Zellkultivierungdurchgeführtwurde. Als Kultivierungsbedingungen wurden das in 6(a) gezeigte Muster der Magnetfelderzeugung,ein Impulsintervall von 2 Sekunden, eine Temperatur der Zellkulturlösung von37°C sowieein Kultivierungszeitraum von 5 Tagen festgelegt.
[0230] DieZellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel IIa-1,mit Ausnahme, dass das Impulsintervall auf 10 Sekunden geändert wurde.
[0231] DieZellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel I-A,abgesehen davon, dass die magnetischen Teilchen II-A durch die magnetischenTeilchen II-B ersetzt wurden. Das Volumenverhältnis zwischen den Zellkulturträgern II-Aund den magnetischen Teilchen II-B betrugt 70:30.
[0232] DieZellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel IIa-1,abgesehen davon, dass die 0,8 g der Zellkulturträger II-A durch 0,2 g der Zellkulturträger II-Bersetzt wurden.
[0233] Eswurden 0,8 g der ZellkulturträgerA und 30 mL einer Suspension, die je Milliliter 2,5 × 105 aus menschlichemOsteosarkom (HOS) abgeleitete Zellen enthielt, einer Menge von 100mL der Zellkulturlösung NissuiMEM zugegeben. Dabei wurden auch 10 Vol.-% fötales Rinderserum der Zellkulturlösung NissuiMEM zugegeben.
[0234] DieseZellkulturlösungwurde in eine Schleuderflasche (von Shibata Scientific TechnologyLtd.) eingebracht, worauf die Zellkultivierung durchgeführt wurde.Dabei waren die Kultivierungsbedingungen durch eine Rotationsgeschwindigkeitdes Rührankersvon 30 U/min, einer Temperatur der Zellkulturlösung von 37°C und einem Kultivierungszeitraumvon 5 Tagen festgelegt.
[0235] Eswurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in VergleichsbeispielIIa-1 vorgenommen, abgesehen davon, dass die Rotationsgeschwindigkeitdes Rührankersauf 60 U/min geändertwurde.
[0236] Eswurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in VergleichsbeispielIIa-1 vorgenommen, abgesehen davon, dass die Zellkulturträger II-Adurch die ZellkulturträgerII-C ersetzt wurden.
[0237] Dieseaus einer Affenniere abgeleitete Zelle hat eine Maximallänge vonetwa 20 μm.
[0238] Eswurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in den BeispielenIIa-1 bis IIa-4und den Vergleichsbeispielen IIa-1 bis IIa-3 vorgenommen, abgesehendavon, dass die aus menschlichem Osteosarkom abgeleiteten Zellendurch die aus einer Affenniere abgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
[0239] Dieseaus einer Steckmücke(Moskito) abgeleitete Zelle hat eine Maximallänge von 20 μm.
[0240] Eswurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in den BeispielenIIa-1 bis IIa-4und in den Vergleichsbeispielen IIa-1 bis IIa-3 vorgenommen, abgesehendavon, dass die aus menschlichem Osteosarkom abgeleiteten Zellendurch die aus einer Stechmückeabgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
[0241] Injedem der Beispiele und der Vergleichsbeispiele wurde eine vorbestimmteMenge der Zellkulturlösung,nach 3 Stunden, 1 Tag, 3 Tagen und 5 Tagen seit Beginn der Kultivierung(Ruhrbeginn) als Probe entnommen. Anschließend wurde die Zahl der anden Oberflächender Zellkulturträger(15 mg) haftenden Zellen ermittelt. Die Zellen wurden gezählt, indemdie mit EDTA oder Trypsin behandelten Zellen mit Trypanblau gefärbt wurden.
[0242] DieErgebnisse sind in den Tabellen 4 bis 6 angegeben.
[0243] Wieaus den Tabellen hervorgeht, weisen alle erfindungemäßen Beispieleungeachtet der Zellart eine höhereZellkultivierungseffizienz als die Vergleichsbeispiele auf.
[0244] Aucheine Änderungdes Impulsintervalls des auf die Magnetfelderzeugung bezogenen Mustersführte inden erfindungemäßen Beispielennicht zu einer großenVariation der Zellwachstumseffizienz. Daraus geht hervor, dass esin den erfindungsgemäßen Beispielennicht erforderlich ist, die Kultivierungsbedingungen beispielsweisein Abhängigkeitder Zellart streng genau einzustellen.
[0245] Dagegenzeigten die Vergleichsbeispiele, in denen zur Kultivierung eineRührflascheverwendet wurde, in Abhängigkeitder Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers eine große Variationin der Effizienz der Zellkultivierung. In den Vergleichsbeispielenvariierte also der Zustand des Zellwachstums ungeachtet der Zellart starkin Abhängigkeitder Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers. Daraus wird deutlich,dass die Optimierung der Kultivierungsbedingungen äußerst schwierigist. Außerdemstellte sich in den Vergleichsbeispielen heraus, dass sich die Zellenvon den Zellkulturträgernlösten.
[0246] Ingleicher Weise wie in den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Beispielenwurde eine Zellkultivierung unter Verwendung der Zellkultivierungseinrichtungennach den 5, 7 und 8 sowie unter Variation des auf die Magnetfelderzeugungbezogenen Musters durchgeführt.Die Ergebnisse waren die gleichen wie in den oben beschriebenenBeispielen.
[0247] Wieaus obiger Beschreibung hervorgeht, ermöglicht es die Erfindung, eineZellkulturlösunggleichmäßig undsanft zu rühren,wodurch ein effizientes Zellwachstum möglich wird.
[0248] Indemdie Strukturen der Zellkulturträgerund der magnetischen Teilchen geeignet eingestellt werden, kanndie vorstehend genannte technische Wirkung noch weiter verbessertwerden.

权利要求:
Claims (47)
[1] Verfahren zur Zellkultivierung, umfassend folgendeSchritte: Zubereiten einer Zellkulturlösung, die zumindest zu kultivierendeZellen und körnigeZellkulturträgerenthält, aufdenen das Anhaften und Wachsen der Zellen möglich ist, und Anwendeneines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, um diese durch die Wirkungdes Magnetfeldes zu rühren,wobei die Zellen an den Oberflächender Zellkulturträgerhaften und wachsen.
[2] Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass die Zellkulturträgerjeweils ein magnetisches Teilchen mit einer Oberfläche undeiner Deckschicht umfassen, die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischenTeilchens bedeckt, so dass Zellen an ihr haften können, wobeidie Zellkulturträgerdurch die Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegtwerden, wodurch die Zellkulturlösunggerührtwird.
[3] Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,dass sich die Intensitätdes auf die Zellkulturlösungangewandten Magnetfeldes zeitlich ändert.
[4] Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,dass sich die Anordnung des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldeszeitlich ändert.
[5] Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet,dass die Dichte jedes Zellkulturträgers im Bereich von 0,8 bis2,5 g/cm³ liegt.
[6] Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, gekennzeichnetdurch ein VerhältnisA/B gleich 2 bis 100, wenn die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger alsA μm unddie maximale Längeder an dem jeweiligen Zellkulturträger anzuhaltenden Zelle alsB μm definiertist.
[7] Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet,dass die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger im Bereichvon 50 bis 500 μmliegt.
[8] Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet,dass die Deckschicht hauptsächlichaus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt wird.
[9] Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet,dass die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basiertenVerbindung hergestellt wird, wobei die Teilchen teilweise in einem Oberflächenbereicheingebettet werden, der die Oberfläche des magnetischen Teilchensumfasst und an diese angrenzt.
[10] Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,dass die Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchengebildet werden und dass die Deckschicht durch Kollision dieserporösen Teilchenmit der Oberflächedes magnetischen Teilchens gebildet wird.
[11] Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,dass die magnetischen Teilchen jeweils durch Mischen eines Harzmaterialsund eines magnetischen Materials gebildet werden.
[12] Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass die Zellkulturlösungferner magnetische Teilchen enthältund diese magnetischen Teilchen durch Anwenden des Magnetfeldesin der Zellkulturlösung bewegtwerden, wodurch diese gerührtwird.
[13] Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass die Intensitätdes auf die Zellkulturlösung angewandtenMagnetfeldes zeitlich geändertwird.
[14] Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet,dass die Anordnung des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldeszeitlich geändertwird.
[15] Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet,dass die Zellkulturträgerjeweils einen Basiskörperaus einem Harzmaterial mit einer Oberfläche und einer Deckschicht umfassen,die zumindest einen Teil der Oberfläche des Basiskörpers bedeckt,so dass die Zellen an der Deckschicht haften können.
[16] Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,dass die Deckschicht hauptsächlichaus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt wird.
[17] Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,dass die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basiertenVerbindung gebildet wird, wobei die Teilchen zum Teil in einem Oberflächenbereicheingebettet werden, der die Oberfläche des Basiskörpers umfasstund an diese angrenzt.
[18] Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,dass die Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchengebildet werden und die Deckschicht durch Kollision dieser porösen Teilchenmit der Oberflächedes magnetischen Teilchens gebildet wird.
[19] Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet,dass die Dichte jedes Zellkulturträgers im Bereich von 0,8 bis1,4 g/cm³ liegt.
[20] Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19, gekennzeichnetdurch ein VerhältnisA/B gleich 2 bis 100, wenn die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger alsA μm unddie maximale Längeder an dem jeweiligen Zellkulturträger anzuhaltenden Zelle alsB μm definiertist.
[21] Verfahren nach Anspruch 12, gekennzeichnet durchein VerhältnisC/A gleich 0,02 bis 10, wenn die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger alsA μm unddie mittlere Teilchengröße der magnetischenTeilchen als C μmdefiniert ist.
[22] Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger im Bereichvon 50 bis 500 μmliegt.
[23] Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass die magnetischen Teilchen jeweils durch Mischen eines Harzmaterialsund eines magnetischen Materials gebildet sind.
[24] Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass die Dichte jedes magnetischen Teilchens im Bereich von 0,8bis 2,5 g/cm³ liegt.
[25] Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass die mittlere Teilchengröße der magnetischenTeilchen im Bereich von 10 bis 500 μm liegt.
[26] Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass die magnetischen Teilchen jeweils eine Deckschicht aufweisen,die zumindest einen Teil der Oberfläche des jeweiligen magnetischenTeilchens bedeckt, so dass die Zellen an der Deckschicht haftenkönnen.
[27] Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,dass die Deckschicht hauptsächlichaus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt wird.
[28] Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet,dass die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basiertenVerbindung gebildet wird, wobei diese Teilchen zum Teil in einemOberflächenbereichein gebettet werden, der die Oberfläche des magnetischen Teilchensumfasst und an diese angrenzt.
[29] Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,dass die Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchengebildet werden und dass die Deckschicht durch Kollision dieserporösen Teilchenmit der Oberflächedes magnetischen Teilchens gebildet wird.
[30] Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass das volumenbezogene Mischverhältnis der magnetischen Teilchenzu den Zellkulturträgernim Bereich von 10:90 bis 50:50 liegt.
[31] Zellkulturträger,dessen Oberflächefür dasAnhaften und Wachsen von Zellen bestimmt ist, umfassend einmagnetisches Teilchen mit einer Oberfläche und eine Deckschicht,die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchensbedeckt und so ausgebildet ist, dass die Zellen auf ihr haften können.
[32] Zellkulturträgernach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass seine Dichte im Bereichvon 0,8 bis 2,5 g/cm³ liegt.
[33] Zellkulturträgernach Anspruch 31 oder 32, gekennzeichnet durch ein Verhältnis A/Bgleich 2 bis 100, wenn die mittlere Teilchengröße des Zellkulturträgers alsA μm unddie maximale Längeder an dem Zellkulturträgeranzuhaltenden Zelle als B μmdefiniert ist.
[34] Zellkulturträgernach einem der Ansprüche31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchengröße des Zellkulturträgers imBereich von 50 bis 500 μmliegt.
[35] Zellkulturträgernach einem der Ansprüche31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht hauptsächlich auseiner Calciumphosphat-basiertenVerbindung besteht.
[36] Zellkulturträgernach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht ausfeinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildetist, wobei diese feinen Teilchen zum Teil in dem magnetischen Teilchennahe dessen Oberflächeeingebettet sind.
[37] Zellkulturträgernach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die feinen Teilchender Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchen gebildet sindund dass die Deckschicht durch Kollision dieser porösen Teilchenmit der Oberflächedes magnetischen Teilchens gebildet ist.
[38] Zellkulturträgernach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Teilchendurch Mischen eines Harzmaterials und eines magnetischen Materialsgebildet ist.
[39] Einrichtung zur Zellkultivierung, umfassend einKultivierungsgefäß zur Aufnahmeeiner Zellkulturlösung,die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, an denendie Zellen haften und wachsen können,und mindestens einen Magnetfeldgenerator zum Anwenden einesMagnetfeldes auf die Zellkulturlösung,um diese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren.
[40] Einrichtung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet,dass die Zellkulturträgerjeweils ein magnetisches Teilchen mit einer Oberfläche undeiner Deckschicht umfassen, die zumindest einen Teil der Oberfläche desmagnetischen Teilchens bedeckt und so ausgebildet ist, dass dieZellen auf ihr haften können,wobei die Zellkulturträgerdurch die Anwendung des Magnetfel des in der Zellkulturlösung bewegtund dadurch die Zellkulturlösunggerührtwird.
[41] Einrichtung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet,dass die Zellkulturlösungferner magnetische Teilchen enthältund dass diese magnetischen Teilchen durch Anwendung des Magnetfeldesin der Zellkulturlösungbewegt werden, wodurch die Zellkulturlösung gerührt wird.
[42] Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet,dass der Magnetfeldgenerator so ausgebildet ist, dass die Intensität des erzeugtenMagnetfeldes zeitlich veränderbarist.
[43] Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 42, dadurch gekennzeichnet,dass der Magnetfeldgenerator so ausgebildet ist, dass die Anordnungdes erzeugten Magnetfeldes zeitlich veränderbar ist.
[44] Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 43, dadurch gekennzeichnet,dass der Magnetfeldgenerator um die Außenfläche des Kultivierungsgefäßes herumangeordnet ist.
[45] Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 43, dadurch gekennzeichnet,dass der Magnetfeldgenerator so ausgebildet ist, dass er in Kontaktmit der Zellkulturlösungkommt.
[46] Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 44, dadurch gekennzeichnet,dass der Magnetfeldgenerator nahe der flüssigen Oberfläche derin dem Kultivierungsgefäß enthaltenenZellkulturlösungangeordnet ist.
[47] Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 46, dadurch gekennzeichnet,dass der mindestens eine Magnetfeldgenerator zwei oder mehr Magnetfeldgeneratorenumfasst.

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公开号 | 公开日

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GB0408221D0|2004-05-19|

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GB2413564A|2005-11-02|

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US20040248291A1|2004-12-09|

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FR2853664A1|2004-10-15|

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GB0508065D0|2005-06-01|

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GB2413564B|2006-05-10|

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GB2400378B|2007-11-21|

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GB2400378A|2004-10-13|

引用文献:

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公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题

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法律状态:
2008-11-20| 8127| New person/name/address of the applicant|Owner name: HOYA CORP., TOKIO/TOKYO, JP |

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2009-05-07| 8130| Withdrawal|

优先权:

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申请号 | 申请日 | 专利标题

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